دليل لمودرن الكمية نيون الغربية التنشيف مع استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها
Summary
The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.
Abstract
شهدت أواخر 1970s أول استخدام تقارير علنية للطخة غربية، وهي تقنية لتقييم وجود وفرة نسبية من بروتينات معينة في عينات بيولوجية معقدة. منذ ذلك الحين، أصبحت منهجية النشاف الغربية عنصر مشترك من علماء البيولوجيا الجزيئية ذخيرة تجريبية. بحث سريع للمجلات استخدام مصطلح "طخة غربية" تشير إلى أن ما يزيد على 220،000 المخطوطات المنشورة جعلت استخدام هذه التقنية بحلول عام 2014. والأهم من ذلك، شهدت السنوات العشر الأخيرة تطورات تقنية التصوير إلى جانب تنمية العلامات الفلورية للحساسية التي تحسنت حساسية وأسفرت نطاقات أكبر من الكشف الخطي. والنتيجة هي الآن قابلة للقياس الكمي الإسفار حقا مقرها البقعة الغربية (QFWB) التي تسمح للعلماء الأحياء لإجراء تحليل مقارن التعبير بقدر أكبر من الحساسية ودقة من أي وقت مضى. العديد من "الأمثل" النشاف الغربيوتوجد منهجيات واستخدمت في مختبرات مختلفة. هذه غالبا ما يكون من الصعب تنفيذ ذلك بسبب متطلبات التعديلات الإجرائية الدقيقة ولكنها غير موثقة. وينص هذا البروتوكول على وصف شامل لطريقة QFWB ثابتة وقوية، مع استكمال استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Introduction
النشاف الغربي (WB) هو تقنية تحليلية وضعت أصلا في أواخر 1970s لتحديد وجود أو عدم وجود بروتين من الفائدة في عينة بيولوجية معقدة، مثل جناسة الأنسجة 1. يشار إلى أن طخة مناعية البروتين، ويرجع ذلك إلى تفاعل الضد مستضد الرئيسي، وتتكون هذه المنهجية من 5 خطوات متميزة: 1) الفصل الكهربي للبروتينات من خلال وجهة نظرهم تساوي الكهربية. 2) نقل إلى النيتروسليلوز أو البولي فينيل difluoride (PVDF) الغشاء. 3) وضع العلامات باستخدام الأجسام المضادة الأولية محددة للبروتين في المصالح؛ 4) الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية الموجهة ضد الأجسام المضادة الأولية. و5) التصور.
وقد تطورت منهجية التصور مع الوقت لتحسين السلامة والحساسية. أجريت بعض WBS الأولى من استخدام الإذاعة علامات المسمى الذي تقدمت بعد ذلك إلى chemilluminescent أكثر استخداما (ECL) طرق اللونية ثم. Radioactiviوكان تاي المسمى مباشرة على تحقيقات لمستضدات معينة في حين تستخدم منهجيات اللونية وECL تقنية وضع العلامات غير المباشرة مع مراسل انزيم مثل الفوسفاتيز القلوية الغلوثانيون أو streptavidin الفجل (HRP) 2. يتم قياس شدة العلامات من chromagen أو الانارة المنتج باستخدام كثافة حيث قوة الإشارة، قوية أو ضعيفة، ويشير أكثر أو أقل وجود البروتين من الفائدة في العينة. أطلق بيت التمويل الخليجي هو منهجية أكثر حساسية، وبالتالي يفضل 2 ولكن وضعت جميع الطرق 3 البداية على فيلم الأشعة السينية مع تقنيات التصوير الرقمي أكثر تطورا أنشئت في وقت لاحق 3. النهوض التصوير الرقمي من البنك الدولي يسمح ليس فقط الباحث لتحديد وجود أو عدم وجود بروتين اهتمامهم، ولكن أيضا يسمح الاستنتاج إلى مستوى التعبير عن بروتين المحددة عند مقارنتها عينات أخرى، وبالتالي يمكن أن يشار إلى "شبه كمي & #8221 ؛. مؤخرا، تم تطوير تقنية النشاف الغربية الكمية حقا، وأكثر حساسية حيث مستوى مضان تقاس يرتبط مباشرة لكمية والتعبير عن بروتين واحد ضمن العينة: الكمية الفلورسنت غرب النشاف (QFWB).
عند مقارنة QFWB مع وضع العلامات ECL، واستخدام الأجسام المضادة الثانوية فلوري يولد لمحة الكشف الخطي 4. هذا هو على النقيض من تقنيات ECL التي يحدث فيها إشارة خطية عموما مع انخفاض الأحمال البروتين أقل من 5 ميكروغرام وإشارة التشبع علاقة مباشرة البروتين التعبير، أي مع الجينات التدبير المنزلي أعرب بتواجد مطلق 5،6. ومن المرجح أن سبب هذا التفاوت من قبل عدد أكبر من مواقع الربط المتاحة لECL الركيزة أفيدين لربط المعقدة البيروكسيديز الثانوية، مما أدى إلى ارتفاع احتمالات تشبع إشارة محتملة. هذا هو واحد من الأسباب الرئيسية لECL قاعدة immunoblotting إحالتها إلى y ……. قل كماذ "شبه كمي" (7). نقطة التشبع من إشارة ذات أهمية حاسمة عند قياس الاختلافات الطفيفة في مستويات التعبير، ويمكن أن تؤدي إلى قياسات غير دقيقة. في السنوات الأخيرة أدى ظهور تقنيات البروتين على نطاق واسع يفصل متزايدة الحساسية وتحديد الفروق الدقيقة في التعبير عن الاعتماد المتزايد على النشاف الغربي الكمي حقا للتجارب التصديق 8،9. تطبيق منهجية حساسة وقوية والكمية حقا هو بالتالي حاسما.
وقد استخدمت العديد من "الأمثل" منهجيات النشاف الغربية من قبل مختبرات مستقلة، والتي يكون من الصعب في كثير من الأحيان إلى إنشاء أو تكرار بسبب التعديلات المنهجية الدقيقة التي قد لا تكون واضحة في بروتوكولات رسمية موثقة. هذا هو بروتوكول الراسخة والقوية لQFWB ويوفر استراتيجيات قيمة لاستكشاف المشاكل الشائعة ثا إضافير قد تنشأ أثناء التنفيذ.
تم تحسين هذا البروتوكول في الأصل للاستخدام مع الخليط دماغ الفئران، ولكن منذ ذلك الحين يستخدم بشكل فعال عبر مجموعة واسعة من عينات الأنسجة وأنواع 4،9،10. تدرج التغيرات المحتملة بروتوكول المطلوبة لقضايا محددة استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Protocol
Representative Results
Discussion
الاعتبار الواجب والتخطيط أمر ضروري قبل أي التجربة ويمكن تحديد نهاية المطاف نجاح التقنية المستخدمة. التقدم في الكشف عن البروتين باستخدام WB يمكن تقديم مجموعة كبيرة من العقبات المحتملة عند محاولة اختيار الأجسام المضادة، ونقل التصور والطرق المناسبة للاستخدام. لحسن الحظ، وذلك باستخدام قائمة مراجعة متأنية وتدابير الرقابة المناسبة QFWB يمكن استخدامها بشكل روتيني لتحديد وجود البروتين والخلافات التعبير خفية متزايد بين العينات. وينص هذا البروتوكول دليل شامل لالفلورسنت النشاف الغربي الكمي فضلا عن عدد قليل من الاستراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتجنب و / أو التغلب على بعض من كثير من المزالق الشائعة المرتبطة به.
الخطوات الحاسمة المستخدمة للحفاظ على حساسية والحصول حقا وتشمل قياسات قابلة للقياس وقابلة للمقارنة: 1) قوي استخراج البروتين من عينات الأنسجة. 2) إعداد العينة؛ 3) دقيقة البروتين من التحميلز يحددها الكلي تحليل البروتين. 4) نقل الأمثل للبروتينات باستخدام I-البقعة. 5) إعداد الأجسام المضادة الأولية والثانوية في عرقلة العازلة التي تحتوي على 0.1٪ Tween20، و6) التصور الصحيح والتحليل باستخدام الأشعة تحت الحمراء تصوير والبرامج المرتبطة بها.
الكشف الفلوري بالأشعة تحت الحمراء هو حقا الكمي ويوفر حساسية أكبر مقارنة مع المزيد من التقنيات التقليدية كشف ECL 3،11. هذا النظام هو الكشف متعدد الأوجه، وعلى هذا النحو لا يقتصر على QFWB. هذا النظام قادر على التصوير من العلامات immunohistological في الطاقة المنخفضة مما يسمح التصور النوعي والكمي لأقسام الأنسجة كلها 12. وهذا هو المجال الوحيد للتنمية المستقبلية المحتملة من حيث القرار الذي يمكن أن نرى التصوير الحمراء بعيدة ينافس اسر المناعي التقليدي مع المجاهر التقليدية من حيث التقييم الكمي.
ومع ذلك، مع حساسية أكبر للتغيرات الطفيفة في صrotein التعبير من الأهمية بمكان لضمان تقلب يتم الاحتفاظ بها إلى الحد الأدنى والسيطرة على تدابير صارمة مع بروتوكولات قوية. هذا يبدأ مع الدقيق استخراج البروتينات من عينة الأنسجة تليها إنتاج البروتين الكلي ملطخة المواد الهلامية لتقديم ضمانات بأن عينة التحميل هو الزي الرسمي، والاستفادة المثلى من الأجسام المضادة الأولية والثانوية من أجل تحديد ما إذا كان كشف حقيقي واختبار المبادئ التوجيهية الشركة الصانعة فيما يتعلق بنقل الأوقات للحصول على نقل البروتين الفعال.
ومع ذلك، وحتى عندما يتم تحسين شروط البنك الدولي، وهناك قد لا تزال المشاكل المرتبطة بإدارة الغربيين قد لا تم استكشافها بالكامل هنا. وتشمل هذه ولكنها لا تقتصر على العوامل من بينها إذابة البروتين واختيار استخراج العازلة. يمكن لبعض مخازن تتداخل مع المقايسات تركيز البروتين، وبعض الأنسجة من الصعب بشكل خاص للذوبان، والتي تتطلب تقنيات أكثر قوة مثل استخدام macera الآليتينغ حاويات مختومة مثل أنابيب M جنبا إلى جنب مع dissociator أجهزة ماكينتوش. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للتدابير الرقابة بسيطة لتخزين المواد المستخرجة وغير المستخرجة-في -80 درجة مئوية يكون الفرق بين الحصول على العلامات الأمثل مباشرة بعد استخراج وجود وقت لاحق من النتائج السيئة أسابيع.
وأثبتت الأساليب الحديثة QFWB أن تكون أكثر حساسية لالتقاط الفروق الدقيقة في تعبير البروتين ويسمحون أكثر تنوعا في وقت واحد وضع العلامات مزدوج 3 بالمقارنة مع التقنيات القديمة مثل ECL. فمن الأهمية بمكان أن بروتوكولات النشاف الغربية هي قوية وقابلة للتكرار بسهولة لالكمي الدقيق والتحليل الإحصائي. هذا البروتوكول هو حساس وقوي بما فيه الكفاية ليتم استخدامها بشكل روتيني للكشف عن البروتينات عبر مجموعة متنوعة من عينات الأنسجة المختلفة والأنواع 3 و يسمح الكمي للبروتينات وفرة المنخفضة والعالية داخل نفس QFWB بالتالي الحد من استخدام الاستهلاكية فضلا عن الوقت في التجربة 11 وبالإضافة إلى ذلك، فإن زيادة حساسية هذه التقنية تتيح التحقق من شعبية متزايدة – دراسات OMIC 9،14 لكن دقة أمر بالغ الأهمية وإدراج تدابير الرقابة المناسبة يجب الالتزام بها وبالتالي تجنب الحصول على البيانات الخاطئة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن يشكر التالية للحصول على الدعم المالي: معهد BBSRC تمويل البرامج الإستراتيجية – CF & TMW. التمويل BBSRC الشرق بيو DTP – LG. داروين الثقة ادنبره – MLH. نود أيضا أن نشكر الدكتور باري مكول للحصول على إذن لتشمل التحسين TREM2 في هذه المخطوطة.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RIPA Buffer | Fisher Scientific UK Ltd | 10230544 | |
| M Tubes | Miltenyi Biotec Inc. | 130-093-236 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Life technologies, UK | IB401001 | |
| MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) | Life technologies, UK | LC5602 | Use in gel 1 for Western blotting |
| SeeBlue Pre-stained protein standard | Life technologies, UK | LC5625 | Use in gel 2 Total protein stained gel |
| NuPAge LDS Sample buffer 4X | Life technologies, UK | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X) | Life technologies, UK | NP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well | Life technologies, UK | NP0322BOX | |
| PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET | Sigma-Aldrich, UK | P4417-100TAB | |
| Micro BCA, Protein Assay Kit | Fisher Scientific UK Ltd | 10249133 | |
| Odyssey blocking buffer | Li-Cor Biosciences | P/N 927-40000 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68071 | |
| IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68072 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32214 | |
| ODYSSEY CL Infra-red imager | Li-Cor Biosciences | Call for quotation | |
| iBlot 7-Minute Blotting System | Life technologies, UK | This model is no longer in production | |
| InstantBlue Protein stain | Expedeon, UK | ISB1L | |
| Revitablot western blot stripping buffer | Rockland Immunochemicals Inc. | MB-085-0050 |
References
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).
- Walker, J. M. . Protein Protocols on CD-ROM. , (1998).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10 (2008).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLoS One. 8 (8), 72457 (2013).
- Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots. Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).
- Colella, A. D., et al. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).
- Zellner, M., et al. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).
- Kielar, C., et al. Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease. Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).
- Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy. Genome Med. 5 (10), 95 (2013).
- Wishart, T. M., et al. Dysregulation of ubiquitin homeostasis and β-catenin signaling promote spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 .
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism. J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).
- Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells. Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).
- Wishart, T. M., et al. Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene. Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).
- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis. J. Vis. Exp. (84), 51149 (2014).
