התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח,<em> Tribolium castaneum</em
Summary
טכניקות גן מציאה מבוססות התערבות RNA (RNAi) נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. כאן, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בcastaneum Tribolium. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה המספקת גישה מהירה לפנוטיפים פסד של פונקציה, המאפשר לחוקרים ללמוד פונקציות גן בהקשרים מגוונים.
Abstract
החיפושית האדומה הקמח, castaneum Tribolium, מציעה רפרטואר של כלים ניסיוניים למחקרים גנטיים והתפתחותיים, כולל רצף מבואר באופן מלא הגנום, transgenesis מבוסס transposon, והתערבות יעילה RNA (RNAi). בין יתרונות אלה, טכניקות גן מציאה RNAi מבוססות נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. ט castaneum להראות תגובת RNAi מערכתית חזקה, כך שניתן לבצע RNAi בכל שלב חיים פשוט על ידי הזרקת פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך חלל הגוף של החיפושית.
בדו"ח זה, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בט castaneum. הפרוטוקול כולל בידוד (i) של השלב הנכון של ט זחלי castaneum להזרקה, (ii) הכנה להגדרת ההזרקה, וכן (iii) הזרקת dsRNA. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה שמספקת לנו גישה מהירה לphenotyp אובדן של הפונקציהes, כולל פנוטיפים מרובים גן מציאה, כמו גם סדרה של פנוטיפים hypomorphic. מאז כמעט כל ט רקמות castaneum רגישות לdsRNA תאי, טכניקת RNAi הזחל מאפשרת לחוקרים ללמוד מגוון רחב של רקמות בהקשרים מגוונים, כולל את הבסיס הגנטי של תגובות האורגניזם לסביבה החיצונית. בנוסף, הפשטות של טכניקה זו מעוררת יותר מעורבות סטודנטים במחקר, מה שהופך את ט castaneum מערכת גנטית אידיאלית לשימוש בסביבה בכיתה.
Introduction
החיפושית האדומה הקמח, castaneum Tribolium, הוא צוברת פופולרי בתחומים שונים של ביולוגיה נובעת בחלקו את הקלות של ביצוע התערבות RNA (RNAi) 1-3. טכניקות גן מציאה מבוססת RNAi לאפשר למדענים לבצע פסד של פונקצית ניתוחים ללא שימוש בשיטות גנטיות מורכבות. ט castaneum להראות תגובת RNAi מערכתית חזקה, כך שניתן לבצע RNAi בכל שלב באמצעות הזרקה פשוטה של פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך חלל הגוף של החיפושית 4-6. מציאה בו זמנית של מספר רב של גנים היא גם אפשרית בט castaneum על ידי הזרקת שתיים או יותר מולקולות dsRNA שונות באותו הזמן 7,8. בנוסף, סדרה של פנוטיפים hypomorphic יכולה להיות שנוצרה על ידי הפחתת הריכוז של הזריק dsRNA 8. תכונות אלו הופכות את החלופות אטרקטיביות טכניקות גנטיות הפוכים מבוסס RNAi לגנטיקה קדימה מסורתית בט castaneum. מאז כמעטכל ט רקמות castaneum רגישות למולקולות dsRNA תאיים 9, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד מגוון רחב של רקמות בהקשרים מגוונים. בנוסף, למרות שדו"ח זה מתמקד בביצוע RNAi בט castaneum, נהלים רבים המתוארים כאן חלים על חרקים אחרים. לכן, פרוטוקול זה שימושי למי שרוצה לבצע פסד של פונקצית הניתוח בהקשרי עניין שלהם בט castaneum, כמו גם עבור חוקרים המבקשים להחיל טכניקה מבוססת RNAi לחרקים אחרים.
הזרקה לתוך dsRNA זחלים מאפשרת אנליזה פונקציונלית במגוון שלבי חיי חיפושית, כוללים זחל, הגולם, ומבוגר בשלבים 4,5,10. יש לנו שדווחו בעבר הפרוטוקול שלנו כולל זחל RNAi לרבות נהלי ביולוגיה מולקולרית 11. בדו"ח הנוכחי, אנו מתמקדים הבמתארים את נהלי הזרקת dsRNA, אשר הסבירו הטובים ביותר עם עוזרים חזותיים. אנו מספקיםנהלים מפורטים צעד אחר צעד הזרקה, כמו גם דוגמאות הזרקה טובות ורעות. פרוטוקול חזותי זו משלים הפרוטוקול הקודם שלנו, וכאשר בשילוב, הם מספקים תמונה מקיפה יותר של נהלי RNAi זחל בט castaneum. בנוסף, אנו דנים פרמטרים למולקולות dsRNA שיכול להשפיע על ההצלחה של RNAi, יישום של מבחני מבוססי RNAi למחקר פיסיולוגי, כמו גם תחולתו של פרוטוקול RNAi זחל במעבדה הוראה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנן מספר הסוגיות החשובות שצריכים להילקח בחשבון על מנת להבטיח את ההצלחה של RNAi, כולל האורך והריכוז של מולקולות dsRNA, תחרות בין מולקולות dsRNA שונות (בעת ניסיון מרובה להפיל), וכן את האפשרות של Off-יעד אפקטים (OTE).
אורך dsRNA
האורך של מולקולות dsRNA משפיע על היעילות של תגובת RNAi המערכתית, עם dsRNA יותר להיות יעיל יותר כדי לעורר RNAi 7,14,15 (אם כי הגבול הארוך של dsRNA אינו ידוע כרגע). אורך dsRNA צריך להיות ארוך יותר מ50 נ"ב לגרום RNAi היעיל בט castaneum 7. dsRNA בין 150 נ"ב ו500 נ"ב נראה אידיאלי עבור ניסויי RNAi. גם למרות שניתן להשתמש במולקולות dsRNA יותר, תהיה להם סיכוי מוגבר של OTE וצעד שיבוט הגנים יהפוך קשה יותר ויותר.
ריכוז dsRNA
ve_content "> דרגות שונות של מציאה גן ניתן להשיג בהתאם לריכוז של dsRNA. 1 מיקרוגרם / μl מופיע להיות ריכוז התחלה סביר, אשר לעתים קרובות מייצר פנוטיפ כמעט ריק (עשוי להשתנות תלוי בגן (ים) של עניין ). ניתן לבצע RNAi עם ריכוז גבוה יותר (לדוגמא, 7-8 מיקרוגרם / μl) כדי לקבל פנוטיפ חזק RNAi. RNAi עם דילול סדרתי של dsRNA לפעמים יכול להיות מועיל כדי לייצר סדרה של פנוטיפים hypomorphic (משלימה נתונים של Tomoyasu et al. 2009 8, ונתונים שלא פורסמו Borràs-Castells).RNAi תחרות
מציאה גן מרובה יכולה להיות מושלמת בט castaneum על ידי הזרקה כמה מולקולות dsRNA שונות בו זמנית. עם זאת, הוא ידוע גם שיש כמה מולקולות dsRNA שונות קיימים בתוך האורגניזם לעתים קרובות תוצאות תחרות בין dsRNAs לגישה לרכיבי RNAi <sעד> 7,14. חשוב להשתמש באותו אורך ואותו ריכוז לכל dsRNA כאשר מנסה מציאה גן רב כדי להימנע מאחד dsRNA מחוץ מתחרה האחרים (אם כי, התאמות נוספות של אורך dsRNA והריכוז עשויים להידרש כאשר רמות הביטוי שונות מאוד בין גני המטרה). אנחנו, כמו גם לאחרים, ביצענו בהצלחה מציאה כפולה ומשולשת (לדוגמא, Tomoyasu et al., 2005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, ויאנג et al. 2009 18). למרות שאפשרי, RNAi המרובע (או יותר) יכול להיות מאתגר, כפי שהוא עלול לגרום לירידה משמעותית של יעילות RNAi לכל ארבעת גני המטרה.
מיקוד-Off
OTE הוא חשש מובנה לגישות מבוססות RNAi. אחת דרכים למזער OTE היא לזהות אזורים בגן המטרה שחולקים רצפים דומים עם גנים אחרים ולהימנע מאזורים אלה בעת תכנון dsRNA. ניתוח תפציץ פשוט נגד T. סט הגן חזה castaneum יכול לזהות אזורים כאלה. כמה כלים מקוונים מאפשרים גם הערכה של OTE הפוטנציאלי (למשל, E-RNAi 19). ביצוע RNAi לשני אזורים שאינם חופפים של גן המטרה הוא דרך קלה ויעילה כדי לשלול את האפשרות שנצפתה פנוטיפים נגרמים על ידי OTE. האפשרות של OTE ממוזערת אם RNAi לשני אזורים שאינם חופפים לייצר את אותו פנוטיפים (אלא אם כן שני אזורים שאינם חופפים לשתף רצף דומה).
הערכת גן מציאה באמצעים אחרים מאשר פנוטיפי מנתח היא לעתים קרובות קריטית לנתונים הקשורים RNAi ביעילות נוכחי. שתי דרכים עיקריות להעריך מציאה גן הן qRT-PCR וניתוח כתם מערבי. qRT-PCR הוא דרך נוחה כדי למדוד את הרמה של mRNA היעד, ונעשה שימוש במחקרים הקשורים לRNAi רבים, כולל אלה בט castaneum (ראה אל מילר ואח. 2012 7 לדוגמא). Howevאה, יש לנקוט בזהירות, כפי שיש לנו לאחרונה ראו כמה מקרים שבי רמת mRNA היעד היא על ידי RNAi מוסדר עד (אם כי מוצר החלבון הוא למטה מוסדר) (נתונים שלא פורסמו Borràs-Castells). לא ידוע כרגע אם mRNA RNAi מושרה זה עד תקנה יכול להיות נפוץ או ייחודי לגנים מסוימים. ניתוח כתם מערבי הוא דרך נוספת כדי לאשר מציאה גן. שיטה זו היא די אמינה כפי שהוא מודד את כמות מוצר החלבון הסופי. הדרישה של נוגדן ספציפי נגד חלבון המוצר של גן המטרה היא חיסרון בגישה זו. ניצול מדידות עצמאיות רבות, בנוסף לניתוח פנוטיפי יגדיל את הביטחון של נתונים פנוטיפי המתקבלים על ידי ניתוח מבוסס RNAi.
מאז ראשיתה בט castaneum, RNAi יש בעיקר נעשה שימוש כדי לחקור את תפקוד גן בפיתוח ויצירת תבנית. ט אלו מחקרים התפתחותיים castaneum היו מוצלחים ביותר בcharacterizing פונקציות אבולוציונית שימור והתפצלו של גנים (שנסקר בDenell 2008 1 וKlingler 2004 2). מחקרים עם זאת, מבוסס RNAi בט castaneum אינם מוגבל לביולוגיה התפתחותית. לדוגמא, יכול להיות מנוצל RNAi ללמוד תפקוד גן במגוון רחב של תגובות פיסיולוגיות והתנהגותיות, כוללים סובלנות מתח, טריפה, תוקפנות, בחירת בן זוג, דפוסי פעילות, ומנגנוני הגנה.
קושי אחד של יישום RNAi להקשרים אלה הוא את הסבירות לתופעות pleiotropic. לעתים קרובות, הגנים של עניין יהיו מגוון של תפקידים ברחבי ט מחזור החיים castaneum, ובכך להפוך את ההסרה של גנים ללא תופעות פנוטיפי לא מכוונות קשות. עם זאת, את היכולת לבצע בקלות RNAi במגוון רחב של שלבים לעתים קרובות יכולה להיות אסטרטגיה יעילה למניעת תופעות pleiotropic אלה. לדוגמא, ביצוע RNAi במבוגרים במקום זחלים או גלמים עשוי לאפשר לנו לעקוף uninנטה קטלני הנגרם על ידי מציאה גן במהלך ההתפתחות מוקדמת. הגמישות של תגובת RNAi בט castaneum כך הופך את המודל הזה לבחירה אטרקטיבית עבור התאמת RNAi לניסויים של תפקוד גן בתגובות פיסיולוגיות והתנהגותיות.
ט מערכת castaneum היא גם אידיאלית לשימוש במעבדה הוראה. ט castaneum יכולה להיות בקלות בתרבית על קמח / תערובת שמרים בטמפרטורת חדר (C ° 25) ללא subculturing תכוף, וטכניקות RNAi בט castaneum פשוטים מספיק כדי להיות מותאמים למעבדה עם מדענים צעירים, לומדים. כRNAi הופך טכניקה חיונית במגוון רחב של תחומים ביולוגיים, זה קריטי, כי תלמידים נחשפים לטכניקה זו. הטבע ישר קדימה של טכניקת RNAi הזחל בט castaneum גם מעודד את תלמידים יותר להיות מעורבים במחקר, מה שהופך את ט castaneum מועמד לכיתת אוריינטציה מערכת גנטית. </ P>
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרכז לביואינפורמטיקה וגנומיקה פונקציונלית (CBFG) באוניברסיטת מיאמי לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת מיאמי מענק הזנק (יט), וקרן הלאומית למדע (יט: IOS 0,950,964).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Organic whole wheat flour | Heartland Mill Inc. Kansas | G1 | |
| Brewer’s Yeast | MP Biomedicals | 2903312 | Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus. |
| 6 oz plastic Drosophila stock bottles | Fisher Scientific | 11-888 | |
| Sieve | Fisher Scientific | 04-881N | 8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710µm) for larvae, pupae, and adults. |
| Sieve | Fisher Scientific | 04 881 10P | 8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600µm) Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder. |
| Sieve receiver | Fisher Scientific | 04-866B | 8 in. diameter |
| 1.5 quart spouted sample pan | Seedburo Equipment Co. | Model 33 | collection pan |
| Incubator | BioCold Environmental Inc | BC26-IN | Keep it 30C with 70% humidity. |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374500 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S397-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Food dye | Kroger | green, blue, or red preferable | |
| Microscope glass slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
| Tack-It Over&Over | Aleene's | Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies. | |
| Plastic CD case | Amazon | ||
| Boroslilicate Glass capillary | Sutter Instrument | BF100-50-15 | O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-87 or P-97 | |
| Silicone seal | Narishige | HI01PK01 | 2.5 mm |
| Removable mounting putty | Loctite Fun-Tak | ||
| Compressed gas duster | OfficeMax | OM96091 | |
| Forceps | Fine Science Tool | 11231-30 | Dumoxel #3 (to manipulate beetles) |
| Forceps | Fine Science Tool | 11252-20 | INOX #5 (to break needle tips) |
| Ethyl ether, anhydrous | Fisher Scientific | E138-500 | |
| Nylon mesh | Flystuff/Genessee Scientific | 57-102 | 120-um pore size/49% open area |
| Media bootle 100-ml | VWR | 89000-926 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | SteREO Discovery V12. Injection microscope. | |
| Stereomicroscope | Fisher/Zeiss | 12-070-513 | Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide. |
| X-Y mechanical stage | Zeiss | 4354600000000000 | |
| X-Y mechanical stage | Microscopenet.com | A512 | Inexpensive alternative |
| Manipulator | Narishige | M-152 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Glass capillary holder | Narishige | IM-H1 | |
| 30-ml disposable syringe | BD syringe | 309650 | BD Luer-Lok Tip |
| Four-way stopcock | Cole-Parmer Instrument Co. | EW-30600-03 | Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip |
| art paint brush | Amazon | Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece | Any general paint brush will work. |
References
- Denell, R. Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo. 유전학. 180, 1779-1786 (2008).
- Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
- Tomoyasu, Y., et al. Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium. Genome biology. 9, R10 (2008).
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi. PLoS ONE. 7, e47431 (2012).
- Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles. Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).
- Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Larval RNAi in Drosophila. Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).
- Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evolutio., & development. 1, 11-15 (1999).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).
- Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle. Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).
- Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC genomics. 14, 5 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. . Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, 2456-2459 (2002).
- Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
- Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
- Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental biology. 333, 215-227 (2009).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents–2010 update. Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).
