יישום של פלורסנט חלקיקים לחקר שיפוץ של מערכת Endo-lysosomal על ידי חיידקים תאיים
Summary
מאמר זה מתאר שיטות לסינתזה ותיוג ניאון של חלקיקים (NPS). הצירופים ויושמו בניסויי דופק מרדף לתייג מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים. מניפולציה של מערכת אנדו-lysosomal על ידי פעילויות של enterica סלמונלה הפתוגן תאיים היו במעקב על ידי הדמיה תא החי ולכמת.
Abstract
חלקיקי ניאון (NPS) עם כימי רצוי, תכונות אופטיות ומכאניות הם כלים מבטיחים לתייג אברונים תוך-תאיים. כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות זהב-BSA-rhodamine צירופים ולתייג את מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים ולעקוב אחר מניפולציות של מסלולים סלולריים מארח ידי enterica סלמונלה הפתוגן תאיים. הצירופים והופנמו בקלות על ידי תאי הלה ומקומיים בendosomes / lysosomes מאוחר. זיהום סלמונלה מושרה סידור מחדש של שלפוחית והצטברות של צירופים ובמבני קרום Salmonella- מושרה. אנחנו פרסנו את חבילת תוכנת Imaris לניתוחים כמותיים של תמונות מיקרוסקופיה confocal. מספר האובייקטים והתפלגות גודלם בתאים הנגועים שאינם היו שונים מאלה בתאי -infected סלמונלה, המציין מאוד שיפוץ של מערכת אנדו-lysosomal ידי WT סלמונלה.
Introduction
חלקיקי ניאון (NPS), כוללים צירופים ומתכת, נקודות קוונטיות, צירופים ופולימר, צירופים וסיליקה, נקודות פחמן, וכו ', משכו תשומת לב רבה במהלך העשורים האחרונים 1,2. בהשוואה לצבעים אורגניים מסורתיים, צירופים וניאון להראות כימיים, תכונות אופטיות ומכאניות רצויות, כגון עוצמת אות חזקה, התנגדות לphotobleaching ו3,4 biocompatibility גבוה. יתרונות אלה הופכים אותם לשיטת בחירה של חישה תאית והדמיה תא חי. יתר על כן, מגוון רחב של צירופים ואלקטרון-צפוף גלוי על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים (EM), המאפשר את השימוש בם לניתוח מיקרוסקופי מתואם, המאפשר שילוב של תא חי מעקב עם מיקרוסקופ אור (LM) ורזולוציה גבוהה יותר ברמת ultrastructural עם EM 5. לדוגמא, צירופים וזהב היו זמן רב ביעילות משמש כחיישנים ביולוגיים בתאים חיים לאבחון רגיש, כמו גם בתחום אימונו-תיוג 6. ים האחרוןtudies עולה כי צירופים וזהב עם גודל וצורה שונים יכול להיות בקלות ספיגה על ידי מגוון גדול של שורות תאים ובאופן שיגרתי להעביר דרך מסלול endosomal, ולכן יש לי יצור פוטנציאל גדול הגיש בקשה למעקב תחבורה השלפוחית תאית ותיוג מערכת אנדו-lysosomal 7,8 .
פתוגנים חיידקים, כגון סלמונלה enterica, flexneri Shigella וחיידקים ליסטריה, פיתחו מנגנונים שונים כדי לפלוש תאי מארח שאינו phagocytic 9. לאחר שהפנים, פתוגנים, מקומי או בcytosol או מוחרם בתאי קרום נכנסים, אינטראקציה נרחבת עם סביבות המארח שלהם ולווסת את אלה לטובת ההישרדות שלהם 10. לדוגמא, enterica סלמונלה מתגורר ומשכפל בתוך תא phagosomal תאית המכונה vacuole המכיל סלמונלה (SCV) על זיהום 11. SCV ההתבגרותtraffics כלפי מערכת גולג'י, עוברים אינטראקציות רציפות עם מסלול endocytic, וגורם להיווצרות של מבנים נרחבים צינורי, כגון חוטי -induced סלמונלה (SIF), מיון tubules nexin, 3 tubules סלמונלה מוביל הפרשת -induced חלבון קרום (SCAMP3), וכו ' . 12-14. לומדים איך חיידקים פתוגנים אלה לתפעל מסלולי מארח תאים חיוני להבנת מחלה זיהומית.
כאן, צירופים וזהב-BSA-rhodamine שמשו כקליעים נותבים נוזל לתייג מערכת אנדו-lysosomal הסלולרית המארח, והפתוגן עיכול Typhimurium serovar enterica אדם סלמונלה (Salmonella) שימש כחיידק מודל ללמוד את יחסי הגומלין של הפתוגן עם לארח מסלול endocytic. צירופים וזהב-BSA-rhodamine תאיים בתאים הנגועים באי ותאים נגועים בסלמונלה WT או זנים מוטנטים היו צילמו על ידי מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה (CLSM).אז תוכנת Imaris שימשה לכמת את ההפצה של צירופים ו, מצביע על כך שזיהום סלמונלה מושרה סידור מחדש קיצוני של endosomes / lysosomes. לאחר התיאור של שיטה זו, יכולים להיות מתוכנן ניסויים מקבילים כדי לעקוב אחר גורל לטווח הארוך של צירופים והמופנמים ולחקור את ההשפעה של חומרים אקסוגניים שונים או גורמים במשק על מסלול endocytic של תאים האיקריוטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת אנדו-lysosomal של תאי יונקים שולטת בתהליכים פיסיולוגיים חשובים, כוללים מזין קליטה, הולכים אותות בתיווך הורמון, מעקב חיסוני, והצגת אנטיגן 17. עד עכשיו, מגוון רחב של סמנים שימש במשך תיוג של לימודי מסלול ומעקב endocytic. לדוגמא, בדיקות Lysotracker הן בדיקות ניאון acidotropic שפות?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 ‘Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments’ and HE1964/18 within priority program 1580.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
References
- Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
- Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).
- Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
- Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
- Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
- Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
- Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
- Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
- Malik-Kale, P., et al. Salmonella – at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
- Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
- Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. Salmonella-induced tubular networks. Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
- Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
- Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. , (2007).
- . . LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).
- Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
- Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
- Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).
