Expression von fluoreszierenden Proteinen in<em> Branchiostoma lanceolatum</em> Durch mRNA Injektion in ungedüngte Eizellen
Summary
Wir berichten hier über die robuste und effiziente Expression von fluoreszierenden Proteinen nach der mRNA-Injektion in unbefruchtete Eizellen von Branchiostoma lanceolatum. Die Entwicklung der Mikroinjektionstechnik in dieser basalen chordate wird den Weg für tiefgreifende technische Innovationen in diesem aufstrebenden Modellsystem, auch in-vivo-Bildgebung und genspezifischen Manipulationen zu ebnen.
Abstract
We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.
Introduction
Bei der Entwicklung, eine einzelne Zelle führt zu einem ganzen Organismus in einem sehr komplexen Prozess, der beide Zellteilungen und Bewegungen beinhaltet. Um die biologische Prinzipien der Dynamik des Zellverhalten besser zu verstehen, haben Entwicklungsbiologen begonnen, fluoreszenzbasierten In-vivo-Imaging-Techniken verwenden. Bestimmten Kompartimenten der Zellen, wie Zellmembranen, kann entweder durch Behandlungen mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, wie dies bereits durch einen Mangel an Spezifität und der Gewebepenetration 1 behindert oder durch die spezifische Einführung in den Embryo von exogenen mRNAs fluoreszierenden Proteinen 2 kodiert. Verschiedene Techniken können für die effiziente Bereitstellung von exogenen Verbindungen, wie mRNAs verwendet werden. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Mikroinjektion, Elektroporation, Beschuss mit Mikropartikeln, Lipofektion und Transduktion 3,4 beschränkt. Obwohl alle diese Ansätze können verwendet werden, um exogene Verbindungen in ein einzuführensich entwickelnden Embryo, erlaubt nur die Mikroinjektion der Anwendung vordefiniert und genauen Mengen in jede Zelle 3. Mikroinjektionstechniken für alle wichtigen Entwicklungsmodell Systeme beschrieben 4 (zB Fruchtfliegen, Fadenwürmer, Zebrafisch, Frösche, Mäuse) sowie für einige alternative Modelle 4, auch für Vergleichsstudien auf das Verständnis der Evolution der Entwicklungsmechanismen abzielen verwendet (zB, Seeanemonen, Ringelwürmer, Seeigel, ascidian Manteltiere, die Schädellose Amphioxus).
Cephalochordata, die zusammen mit Manteltieren und Wirbeltieren Herstellung der Chordaten Stamm, sind besonders gut geeignet, Modelle, die Entwicklung der Chordaten und die Diversifizierung der Wirbeltiere von einem wirbellosen Vorfahren 5-8 studieren. Die Schädellose Linie abwich sehr früh während der Chordaten Evolution; und vorhandenen Cephalochordata, die in drei Gattungen unterteilt sind (Branchiostoma, Asymmetron und Epigonichthys), ähneln Wirbeltieren sowohl in Bezug auf die gesamte Anatomie und Genom-Architektur 8.5. Von den etwa 30 Arten von Cephalochordata, die bisher beschrieben wurden, fünf sind für embryologische und Entwicklungsstudien 6,9 verfügbar: Asymmetron lucayanum (der Bahama Lanzettfisch) Branchiostoma floridae (der Florida Amphioxus) Branchiostoma lanceolatum (Europäische Amphioxus) Branchiostoma belcheri (die chinesische Amphioxus) und Branchiostoma japonicum (der japanische Amphioxus). Reife Erwachsene von drei dieser Arten (B. lanceolatum, B. belcheri und B. japonicum) induziert werden kann, um bei Bedarf während der Brutzeit 10,11 laichen. Darüber hinaus zumindest für B. lanceolatum, effiziente Laich kann auch in künstlichem Meerwasser 12 induziert werden, wodurch diese besondere Schädellose Arten zugänglich für laboratorer Jahren, die keinen Zugang zu natürlichen Meerwasser. Die Kombination, in B. lanceolatum, eine bequeme und sichere Zugang zu Embryonen mit einem effizienten Liefermethode, wie Mikroinjektion, bisher das einzige Fördertechnik, bei Amphioxus entwickelt (sowohl in B. floridae und B. belcheri) 13-15, wird die Entwicklung einer zu ermöglichen neue Suite von manipulativen Techniken, einschließlich Linie tracing- und dynamische Zellverhaltensbasierte Ansätze.
Ein Protokoll für die effiziente Mikroinjektion von mRNAs, um fluoreszierende Proteine, die in dem B. auszudrücken lanceolatum Embryo wurde daher entwickelt. Darüber hinaus, um einen grundlegenden Toolkit für Live-Imaging von B. liefern lanceolatum Embryonen wurden Vektorsysteme entwickelt, die membranassoziierten und nukleare Expression von fluoreszierenden Proteinen ermöglichen. Für Membran Targeting wurde enhanced green fluorescent protein (eGFP) in die menschliche HRAS CAAX-Box und Kernlokalisation von mCherry und eGFP fusioniert wardurch Fusion an der Zebrafisch Histon 2B (H2B) Exon (Abbildung 1, Ergänzungs Datei 1) erhalten. Weiterhin mit dem Ziel, um die Proteintranslation zu optimieren, die Kozak-Sequenzen und Codons der Konstrukte wurden modifiziert und auf den Einsatz in B. angepaßt lanceolatum. Zusammengenommen können die hier vorgestellten Einspritzverfahren und Expressionsvektoren, als Grundlage für die Erzeugung von neuen experimentellen Ansätzen für Kephalochordaten dienen, insbesondere Analysen unter Verwendung der in vivo-Abbildungstechniken letzte Fluoreszenzbasis.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel zeigen wir, zum ersten Mal, eine detaillierte und reproduzierbare Protokoll für die Injektion von B. lanceolatum Oozyten, die nach B. floridae 13,14 und B. belcheri 15, ist somit die dritte amphioxus Spezies, für die eine solche Technik ist beschrieben worden. Wichtig ist, dass das hier beschriebene Protokoll enthält auch die Beschreibung des Vektor-Systeme zur Herstellung von fluoreszierenden Proteinen in B. geeignet lanceolatum von…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken, die Unterstützung durch die "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" für die Tierhaltung zu bestätigen. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 und ANR-11-JSV2-002-01) zu Michael Schubert, die von der Europäischen Union RP6 grant "Embryomics" und von der ANR grant "ANR- 10-BLAN-121.801 Dev-Process ", um Jean-François Nicolas und Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho wird von einem FCT Stipendium finanziert (SFRH / BD / 86878/2012).
Anträge für die hier beschriebenen Vektoren können direkt an die Autoren angesprochen werden.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1L) | Fisher | W21719 | 0.22 micron filtration |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 micron filtration tube |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | SIGMA | A9414 | |
| Phenol Red | SIGMA | 114537 | |
| Glycerol | SIGMA | G2025 | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | SIGMA | P9155 | |
| H2O Dnase, Rnase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH8 | SIGMA | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | SIGMA | C0549 | |
| 5:1 phenol pH4.7:chloroform | SIGMA | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200x magnification | Leica | MZ16F | 25x oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | heating-filament needle puller |
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
- Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
- Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
- Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
- Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
- Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
- Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
- Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
- Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
- Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
- Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
- Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
- Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
- Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
- Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
- Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
- Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
- Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
- Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
- Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
- Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
- Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
- Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).
