Electroporated Chick Embriyonik Omurilik Diferansiyel Gen İfade RNA Sıra Analizi
Summary
This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.
Abstract
In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.
Introduction
Ovo elektroporasyon DNA 1-5 yapıları ile kısmen in vivo embriyonik yapıların transfect için hızlı ve ucuz bir şekilde temsil ettiği için canlı organizmalar üzerinde genetik araştırmalar sık sık bir model olarak tavuk embriyo kullanın. Örneğin pCIG 6 veya 7 PMES gibi, ilgi konusu gen ile birlikte, bir flüoresan raportör ihtiva eden ve bir transkript şifreleyen bisistronik ekspresyon vektörleri, alt analizi için embriyolar işlemeden önce bir stereo mikroskop altında arzu edilen bir bölgede transfeksiyon kalitesinin hızlı doğrulama sağlar.
DNA dizilimi son gelişmeler ile, RNA-seg 8,9 kullanılarak RNA örneklerinden dijital tüm transcriptome ifade profillerini elde etmek artık mümkün. Bu yüzden, bunun yerine örneğin, in situ hibridizasyon, immünohistokimya ve qPCR, cDNA kütüphanelerinin hazırlanması için olduğu gibi paralel olarak sadece birkaç gen ürünlerinin, analizine imkan veren zaman alıcı bir yöntemYüksek verimli sekanslama, tüm transcriptome bilgi sağlayabilir. Her bir genin ekspresyon seviyeleri üzerindeki deneysel etkilerinin gözlenmesi da kullanılan yapı tarafından değiştirilmiş yolları üzerinde güçlü bir anlayış temin edebilmektedir. Bu, kullanılan organizma için bir genomik montaj varsa özellikle kolaydır, böylece civciv embriyo yine uygun bir modeldir.
Kullanıcı güvenilir bir genom dizileme merkezine erişimi varsa, ana konu yüksek kaliteli RNA örnekleri elde edilir. Bu çalışma, elde edilen veri setleri in silico analiz için RNA sekansına uygun transfekte sinir tüpleri, hem de alt adımları RNA örnekleri elde etmek için bir yöntemi gösterir. 48 saatlik bir inkübasyon takip HH12-13 de Elektroporasyon işleminden sonra, transfekte edilen gövde omurilik yarısı, ribonükleaz içermeyen koşullarda kesilmiş, hemen yok edilmekte ve daha fazla RNA saflaştırma işlemi ve kütüphane preparatın kadar ultra-düşük donma bozulmaya karşı korunaniyonu temsil etmektedir.
Galaxy public server 10 yüksek verim sıralama verilerini analiz etmek için ücretsiz kaynaklara erişim sağlar. Kayıtlı kullanıcılar için sunulan alan miktarı böylece lokal hesaplama altyapısı için ihtiyacı ortadan kaldırarak, küçük deneyler için yeterli. RNA Dizi veri analizi filtreleme, uyum ve gen ekspresyonunun nicelendirilmesi / karşılaştırmayı içermektedir. RNA-Seq veri analizi için genel kurallar olmasına rağmen, filtreleme parametreleri dizileme kalitesine bağlı olacaktır ve ham verilerin kalite kontrol analizinden sonra tespit edilmelidir.
Bu protokol almak ve in vivo transfekte tavuk embriyonik omurilik RNA-Dizi profillerini karşılaştırmak için adımları açıklar. Temsili bir sonucu olarak, bir boş vektör ile transfekte edilmiş iki farklı kontrol numunelerinden elde edilen veri setlerinin karşılaştırılması yöntem, yeniden üretilebilir ve farklı olarak Expres tanımlanmasına olanak gerektiğini gösterdiDeney örneklerindeki SED transkript. Bu nedenle, bu yöntemin uygulanması büyük ölçüde tek bir deneyde sonra keşiflerin sayısını artırmak ve böylece müteakip soruşturma için büyük bir veri kümesi sağlamak potansiyeline sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tavuk omuriliğin elektroporasyon sonra etkilerini analiz etmek için yönergeler sağlamak. DNA vektörlerine elektroporasyonu daha sık ilgi konusu bir geni fazla-sentezlemek üzere kullanılmasına rağmen, tek bir gen fonksiyonu yok etme koşulları 19-21 oluşturmak üzere siRNA'lar dominant negatif, quimeric proteinler veya öncülerini kodlayan yapıları kullanabilir. Aslında, gain- ve kayıp fonksiyon-analiz hem kaynaklanan transcriptome profilleri karşılaştırılması farklı şekilde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CYIY is supported by FAPESP (2012/14421-5) and FMV is supported by a fellowship from FAPESP (2009/53695-0). We thank the DNA Technologies Core at University of California, Davis for preparation and sequencing of the RNA-Seq libraries used in this work, the Galaxy team for providing an excellent and free interface for high-throughput sequencing data analysis tools and Dr. Marianne Bronner for allowing us to film in her laboratory space.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Indian ìnk | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| – 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| – 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| – 0.225 g CaCl2.2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| – 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| – 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| – ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| – ddH2O to 1 L | |||
| – Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| – 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| – 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| – 1.15 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| – 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| – ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| – ddH2O to 1 L and filter | |||
| – 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| – Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| – Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).
- Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).
- Ghadge, G. D., et al. Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord. Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).
- Megason, S. G., McMahon, A. P. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129 (9), 2087-2098 .
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).
- Cloonan, N., et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).
- Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice. BMC Biol. 6, 40 (2008).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. . Molecular cloning. A laboratory manual. , (1982).
- Wang, Y., et al. Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens. BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors. Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).
- Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).
