Un tissu microarray de nouvelle génération (ngTMA Protocol) pour les études de biomarqueurs
Summary
Le protocole vise à optimiser la construction et la qualité des puces de tissus pour la recherche de biomarqueurs. Il comprend des aspects de la planification et de la conception, de la pathologie numérique, toboggan annotation virtuel, et de formation de réseau de tissu automatisé.
Abstract
la recherche de biomarqueurs s'appuie sur des puces tissulaires (TMA). TMA sont produites par le transfert répété de petites carottes de tissu à partir d'un bloc de «donneur» dans un bloc "destinataire" et ensuite utilisé pour une variété d'applications de biomarqueurs. La construction du TMA classique est de main-d'œuvre, imprécis, et de temps. Ici, un protocole utilisant tissue microarrays de prochaine génération (ngTMA) est décrite. ngTMA est basé sur la planification et la conception de TMA, de la pathologie numérique, et microréseau tissulaire automatisé. Le protocole est illustré par un exemple de 134 patients atteints de cancer colorectal métastatique. Aspects histologiques, statistiques et logistiques sont pris en compte, tels que le type de tissu, les régions histologiques spécifiques, et les types de cellules à inclure dans la TMA, le nombre de spots de tissu, taille de l'échantillon, l'analyse statistique, et le nombre de copies de la TMA. Lames histologiques pour chaque patient sont numérisés et téléchargés sur une plate-forme numérique en ligne. Là, ils sont perçus et annotated (marqué) à l'aide d'un outil de diamètre 0,6 à 2,0 mm, de multiples fois en utilisant différentes couleurs pour distinguer les zones de tissu. blocs de donateurs et 12 blocs «bénéficiaires» sont chargés dans l'instrument. Diapositives numériques sont récupérés et adaptés à bloquer les images des bailleurs de fonds. Formation de réseaux répétée des régions annotées est automatiquement effectuée entraîne un ngTMA. Dans cet exemple, six ngTMAs sont prévus contenant six types de tissus différents / zones histologiques. Deux exemplaires des ngTMAs sont souhaitées. Trois à quatre lames pour chaque patient sont analysés; 3 pistes d'analyse sont nécessaires et effectué la nuit. Toutes les lames sont annotés; différentes couleurs sont utilisées pour représenter les différents tissus / zones, à savoir le centre de la tumeur, l'invasion avant, tumeur / stroma, métastases ganglionnaires, métastases hépatiques, et les tissus normaux. 17 annotations / cas sont faites; temps pour l'annotation est de 2-3 min / cas. 12 ngTMAs sont produits contenant 4556 points. Temps rangeant est de 15-20 heures. Grâce à sa précision, flexibilité et rapidité, ngTMA est un puissantoutil pour améliorer la qualité des TMA utilisé en recherche clinique et translationnelle.
Introduction
Au cours des deux dernières décennies, tissue microarrays (TMA) ont eu un impact remarquable sur les études d'enquête sur les biomarqueurs. TMA sont essentiellement des tissus «archives» produites par le transfert répété de petites carottes de tissu, généralement allant de la taille de 0,6 à 2,0 mm de diamètre, de paraffine blocs «donateurs» en un seul bloc "bénéficiaire" TMA (Figure 1) 1. En utilisant une petite taille de base, environ 500 différents endroits de tissus de peu ou beaucoup de patients différents peuvent être disposés dans un TMA-2.
L'utilisation de TMA pour des études de biomarqueurs pronostiques ou prédictifs présente de nombreux avantages. Prenons l'exemple où l'expression d'un biomarqueur protéique par immunohistochimie doit être évaluée sur 450 patients. Plutôt que d'effectuer les taches 450 immunohistochimiques sur les lames 450 patients en coupe du même nombre de blocs, de petits noyaux de chaque échantillon peuvent être disposés sur un seul Tbloc de MA. Même si plusieurs cœurs sont prélevés de chaque patient individuel, un nombre minimum de blocs sont produits. Cela a pour effet de diminuer considérablement considérablement les coûts et d'autres ressources ainsi que la réduction de détérioration des tissus. En outre, cette étude permet alimenté de façon appropriée au moyen d'un grand nombre de tissus à être évaluées dans les mêmes conditions expérimentales.
TMA ont de nombreuses applications différentes. Par exemple, ils peuvent être utilisés pour étudier la morphologie, l'expression des protéines, l'expression d'ARN et d'ADN suivantes aberrations coloration avec des colorants différents, ou après l'immunohistochimie ou même chromogène et hybridation fluorescente in situ en 7.3. Des études récentes ont également utilisé TMA pour tester la variation intra et inter dans les protocoles de coloration, d'établir la spécificité ou la sensibilité des anticorps pour les mutations de gènes spécifiques, et pour déterminer la reproductibilité inter-observateur de l'expression de protéines dans des collaborations internationales <sup> 8-11.
La construction du TMA traditionnelle en utilisant des tissus de patients dérivés est une longue procédure en plusieurs étapes (figure 2). Il commence par une recherche d'éventuels cas appropriés et la sélection des diapositives de diagnostic des archives à un institut de pathologie, ou autre institut, d'où ils sont extraits. Le pathologiste évalue chaque diapositive par cas et sélectionne la diapositive la plus représentative pour les fins de l'étude. Ensuite, la région d'intérêt est marqué à l'aide d'un stylo, directement sous le microscope. C'est souvent difficile et imprécise et entraîne uniquement une «estimation» de l'endroit où poinçons de tissus doivent être prélevés. Ensuite, les blocs de paraffine correspondant à ces diapositives marqués sont récupérés à partir de l'archive. Une comparaison rapide entre le bloc et lame est faite. L'utilisation d'un semi-automatisé arrayer maison ou un tissu, le bloc donneur est percé dans la région d'environ intérêt et transféré dans un bloc receveur TMA. Construction de TMA en utilisant cette technique de formation de réseau est de main-d'œuvre, de temps, imprécis, et inflexible. Préparation d'une TMA de 475 points en 3 exemplaires est estimée à environ 84 heures de travail.
Une nouvelle approche de la construction de TMA a été récemment mis en place par l'Institut de pathologie de l'Université de Berne qui repose sur trois composantes: la planification et la conception (ou conseil), la pathologie numérique combinée à une expertise de l'histologie et automatisé TMA rangeant 12. Ensemble, ce concept est appelé prochaine génération de puces à ADN de tissus (ngTMA). Ci-dessous, un protocole pour ngTMA est décrite sur la base de, par exemple, de 134 patients atteints d'un cancer colorectal métastatique. Ici, des tumeurs primaires ainsi que des métastases des ganglions lymphatiques et les métastases hépatiques sont à être rangé dans ngTMAs pour l'analyse ultérieure de biomarqueurs. En outre, de petites carottes de tissus provenant de chaque patient sont désirés pour l'avenir extraction d'acide nucléique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, un protocole pour ngTMA est décrite. ngTMA est un concept nouvellement créé pour microréseau tissulaire comprenant la planification et la conception, la pathologie numérique et diaporama annotation ainsi que automatisé microréseau tissulaire 12.
Par rapport à microréseau tissulaire classique, ngTMA offre de nombreux avantages. Dans une première étape, la phase de planification et la conception est critique. L'accent est mis sur la réponse à une question de recherche ciblée. Cela devrait prendre en considération les questions histologiques (par exemple, quelles sont les régions et le nombre de points que je veux comprennent?), La planification statistique (par exemple, la taille de l'échantillon? Comment puis-je analyser mes échantillons plus tard?) Et des considérations logistiques (par exemple, comment de nombreux biomarqueurs et donc le nombre de copies ngTMA?). Un ngTMA spécifique est faite pour des besoins spécifiques, que ce soit pour le dépistage des biomarqueurs et à haut débit ou l'intention d'étudier les aspects histologiques spécifiques sur quelques-unes CAS bien choisies.
Un, sinon le, désavantage le plus important de microréseau tissulaire classique est la faible précision avec laquelle les marquages sur les lames histologiques sont pratiquées. L'étude des structures histologiques, des cellules ou des régions spécifiques est faite presque impossible. ngTMA permet une grande précision car annotations sont placées directement sur les diapositives numériques. Cela permet au chercheur de choisir précisément les régions à perforer, y compris des cellules spécifiques. Dans cet exemple, différents domaines au sein du même bloc de tissu sont découpées pour rangeant, comme centre de la tumeur, le front de l'invasion et de domaines d'interaction tumeur / stroma mis en évidence par la présence de petits amas de cellules tumorales ou même des cellules individuelles. Cette précision ne peut être obtenue à l'aide ngTMA. Troisièmement, parce que les diapositives sont numérisées sur une plate-forme numérique sur le Web, faites glisser la visualisation et l'annotation peut être faite par l'ordinateur plutôt qu'avec le microscope. Le logiciel de formation de réseaux de tissus fournit un outil convivialinterface avec un haut degré de flexibilité, donc différentes mises en page et la conception ngTMA peut être atteint. Depuis la construction TMA est effectuée automatiquement par le forage, il n'est guère nécessaire pour est considérablement réduite mains sur les manœuvres et le temps de construction. Le temps de construction TMA dans cet exemple ici est entre 24 h. En utilisant une approche conventionnelle TMA et l'estimation de 15 coups par heure, ce projet prendra environ 304 heures.
ngTMA peut être appliquée pour étudier l'expression de la protéine, de l'ARNm ou de l'ADN, ainsi que des combinaisons de ceux-ci. figure 9 illustre plusieurs de ces applications de biomarqueurs potentiels. Immunohistochimie standard peut être utilisé pour déterminer l'indice de prolifération de cancers en utilisant Ki-67. Une approche combinée pour étudier l'expression des protéines et de l'ADN pour l'amplification des gènes tels que HER2 peut être utilisé. Les tissus peuvent être rassemblés sur un seul ngTMA de réduire les coûts, l'utilisation de tissus et d'autres ressourcess. En outre, l'ARNm par hybridation in situ chromogène pour HER2 et d'autres gènes peut être réalisée en d'identifier des transcrits d'ARNm individuels dans un grand nombre de cas à l'aide d'un nombre minimal de lames de tissu. L'immunohistochimie de marqueurs immunitaires telles que CD8 peut être visualisé dans le contexte du micro-environnement de la tumeur. Double immunohistochimie peut également être utilisé pour mettre en évidence les régions d'intérêt particulier tels que les interactions entre les cellules immunitaires (marquées en rouge) et les cellules tumorales (marquées en brun) à l'avant de l'invasion des cancers. Une telle région d'intérêt n'a pas pu être capturée à l'aide de microréseau tissulaire classique.
Néanmoins, ce protocole contient certaines limites. Le défi le plus important est le chevauchement entre le bloc des bailleurs de fonds et diaporama numérique. Plusieurs facteurs peuvent influencer cette étape. Tout d'abord, la dernière section du bloc doit être utilisé pour la numérisation de diapositives. Dans de nombreux cas, l'H & E ne sont pas de la dernière section du bloc donneur, Rather est une coloration immunohistochimique ou d'une autre. Dans ce cas, également une lame colorée peut être utilisé aussi longtemps que la dernière tache est numérisé et annoté ou un nouveau H & E doit être effectué. Il faut également être prises lors des coupes de tissus sont faits comme les tissus peuvent se développer dans le bain d'eau qui conduit à l'alignement difficile de diapositives et bloc. Deuxièmement, à l'heure actuelle des projets sont limités à 12 destinataires TMA blocs traités en une seule fois. Les grands projets de plus de 12 TMA doivent être affectés à un deuxième nom du projet. Troisièmement, les blocs donneurs doivent être faites en utilisant des moules et des cassettes standard que l'instrument ne peut pas s'adapter à différentes tailles. Enfin, les blocs donneurs doit dépasser la hauteur minimale (4 mm) pour réaliser le forage optimale. Dans certains cas, cela nécessite reembedding de tissus.
Des centaines de publications au cours des dernières années mettent en évidence la TMA comme un outil précieux pour la recherche de biomarqueurs. TMA ont été utilisées pour étudier poumon 13, 7 colorectal, breast 14, de la prostate 15, 16 pancréas, de la vessie 17, et 18 cancers gastriques, pour n'en nommer que quelques-uns. Un nombre croissant d'auteurs ont combiné l'utilisation de TMA avec l'analyse de l'image et des progrès importants sont faits dans ce sens 19-21. Cependant, à côté d'une poignée de groupes de recherche qui ont publié des idées novatrices TMA 22-24, peu d'attention a été accordée à optimiser la technique TMA lui-même. Microarrayers tissulaires automatisés, tels que l'ATA-27 par Estigen / Beecher fournissent conception de mise en page et la perforation des tissus rapide et automatisé. Cela représente toutefois une seule aspect du concept ngTMA.
ngTMA est une amélioration importante par rapport aux techniques de microréseau tissulaire classiques. Il intègre l'expertise de l'histologie et de la conception de TMA avec la flexibilité de la pathologie numérique et la précision des annotations numériques avec la vitesse et la fiabilité de la construction TMA automatisé. La combinaison de ngTMUne analyse d'images pour l'évaluation des protéines biomarqueurs moléculaires et sera un outil puissant pour améliorer encore la qualité de la recherche clinique et translationnelle à l'avenir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le personnel technique de l'Unité de recherche translationnelle; Marie Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni et l'équipe informatique de l'Institut de pathologie de l'Université de Berne.
Materials
| Pannoramic 250 Flash II | 3DHistech | Slide scanner | |
| TMA Grandmaster | 3DHistech | Tissue Microarrayer | |
| Pannoramic Viewer | 3DHistech | free | Slide viewing software |
| Case Center | 3DHistech | Digital slide platform |
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