フラットの床の空輸プラットフォーム：げっ歯類の移動自由アウェイクに顕微鏡または電気生理学と行動を組み合わせるための新しい方法

ここで紹介するすべての手順は、動物のケア（動物実験（2006分の62）にフィンランドACT）のためのローカルのガイダンスに従って行った。動物ライセンス（ESAVI/2857/04.10.03/2012）は、地方自治体（ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA）から入手した。成体マウス（生後1〜3ヶ月、体重20〜40グラム）は、ヘルシンキ大学の認定を動物施設におけるグループの住宅ケージで飼育し、餌と水を自由に与えた。 1。頭蓋窓注入以下に簡単に説明するように頭蓋窓は、わずかな変更を加えて公開されたプロトコルに応じて29から31に移植されています。 頭蓋窓注入を開始する前に、機器を滅菌する。術後合併症のリスクを最小限に抑えるために、手術中に無菌状態を維持する。 鎮痛剤を投与し（ケトプロフェン、2.5 mg / kg）を30分で手術前と24時間後に手術。アンケタミン（80 mg / kgで）の混合物を使用して、マウスをesthetizeおよびキシラジン（10 mg / kgの）を腹腔内注射した。定期的に足をつまんで麻酔深度を監視します。 37.0℃で、動物の体温を維持するために、加熱パッドを使用し手術によって誘導される炎症や脳浮腫を軽減するために、皮下注射によってデキサメタゾン（2ミリグラム/ kg）を管理します。 乾燥なってから目を保護するために目の潤滑剤を塗布。マウスの頭を剃ると剃らエリアを清掃してください。額に首筋からのラインに沿って、外科はさみや鉗子を用いて皮膚をカット。頭蓋骨に接続された任意の結合組織を除去します。 じっくりと高速外科ドリルを使って左の前頭骨に小さな井戸のドリル。掘削井戸に（材料を参照）、ミニボルトをねじ込みます。ねじのない複数の半フルターンを行っていません。 注：直接表面的な皮質血管の上に配置されたそれらの領域を避けてください。これらのVESの破壊SELSは大量出血につながることができます。 開頭を実行するには、右頭頂骨に円形の窓（直径3〜3.5ミリメートル）を開けます。 100μg/mlのペニシリン100単位/ mlおよびストレプトマイシンを補充した蒸留H 2 O中の皮質バッファのドロップ（125mMのNaCl、5mMのKCl、10mMのグルコース、10mMのHEPES、2mMのCaCl 2を 、および2mMのMgSO 4を適用する/ ml）と慎重に円形の窓の内側に配置された骨の一部を除去。 注：細胞の特定の亜集団で蛍光タンパク質を発現する手順のこの時点で、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターまたは他のウイルスベクターの頭蓋内注射を実行する。 頭蓋窓の丸いガラスカバースリップ（＃1.5厚みコード）を置きます。アクリル接着剤で頭蓋骨にカバースリップを取り付けます。カバースリップの上に金属製ホルダーを配置し、歯科用セメント、ポリアクリル接着剤の混合物で固定します。 注：上記の手順は、頭蓋のWindows用に最適化されています光学イメージング実験に使用した。電気生理学的実験に適した「反転」頭蓋窓を製造するために、別の手順を使用します。まず、頭蓋骨に金属ホルダーを接着します。ビデオに例示したようにホルダーの開口部内に円形の窓を開けます。代わりに、脳の動き32を防止または最小化するために、関心領域にわたって小さい開頭（直径0.5mm未満）を作る。皮質バッファを更新するか、頭蓋窓上のシリコーン接着剤の滴を配置し、丸いガラスカバースリップで閉じます。 操作が完了した後に、容易にアクセス可能な食料と水を温めてケージに動物を配置します。それは麻酔から完全に回復した後にのみ、グループの住宅ケージに動物を返します。移動する不本意、飲食、体重減少、流涎、立毛、または異常な呼吸音などの痛みの兆候を検出すると、再投与する鎮痛剤、。 2。アニマLの取り扱いそのケージからマウスを取り出し、単純に5〜10分間、それを保持します。動物の処理中に冷静に、ぎくしゃくした動きや音を立てないようにしてください。 取り扱った後、そのケージにマウスを返す。 実験者とのマウスを快適にするために、取り扱いのエピソードの間に不均等な間隔で処理手順2-3Xを繰り返します。 小さな柔らかい布切れを取り、不等間隔で動物2〜3倍をラップします。 動物は落ち着いてラップさに慣れる必要があります。マウスは興奮して緊張している場合は、取り扱いやラッピングの手順を繰り返します。 3。ペットのためのトレーニング取り扱いやラッピングに慣れた後、次の日が終了し、モバイルホームケージ内の動物のトレーニングを開始。 動物の前とトレーニング中に毎日量る記録します。 NOTE：トレーニング中に、動物がその重量の10％以上を失った場合は、トンから除外すべき彼の実験。 訓練された動物の大きさに合わせるために、モバイル装置のホームケージ頭部固定アームの垂直位置を調整する。標準的な実験加圧された空気出口（典型的には、ガスタンクいるか、すなわち 、約5バール〜300リットル/分、十分に高い圧力および空気流の速度を提供する空気ポンプ）への装置の空気入口に接続します。 ぼろ動物をラップします。 ヘッド固定アームに、動物の頭に取り付けられた金属製ホルダーを挿入して、しっかりとネジを締めて固定します。空気の流れをオンにして、空気の流れが空輸ホームケージの自由浮揚に最適であることを確認してください。ぼろを削除することで、モバイルホームケージに動物を放します。 ノイズに動物を慣らすために、すべてのトレーニングセッション中だけでなく、実験の間（例えば、ラジオや録音された音楽や音声を使用して）周囲の音を一定のエクスポージャーを提供します。 D最初のトレーニングセッションをuring、トレーニングセッションが終了するまで消灯して、最初の1時間に室内光を保持します。 モバイルホームケージでの訓練の2時間後に、頭部固定から動物を解放し、水や食料の供給とのケージに戻します。安静時の条件下で少なくとも2時間そのままにしておきます。 70％エタノール溶液を用いて、各トレーニングセッションの後、モバイルホームケージをきれいにし、水道水ですすいでください。使い捨てのペーパータオルで水を吸い取り、次に使用する前に、モバイルホームケージを乾燥させます。 動物が訓練されている間に室内灯で、2時間の連続した​​研修を行ってはオフ。 一日二回のトレーニングセッションを実行します。 8から12のトレーニングセッションの後、一度に最大2時間の実験セッションで動物を使用しています。 注：以上の1〜2時間持続する長時間のトレーニングセッション中に、マウスWを提供することを検討手動またはモバイルホームケージフレームに取り付けられたピペットホルダを用いて送達することができる飲料水、i番目。あるいは、水は、モバイルホームケージの壁に直接ハイドロゲルの粘性の液滴を配置することによって、動物の自由摂取用に供給することができる。 注：いずれかの慢性的なストレスの影響を除外するために訓練する前に、毎日動物を比較検討することを忘れないでください。どの時点でも、そのような凍結、発声、またはストレス誘発性の下痢などのストレス反応を示して、いる場合の実験からの動物を除外します。 4。アプリケーションモバイルホームケージの周りを移動覚醒マウスにおける二光子イメージングモバイルホームケージを組み立てます。ブリッジヘッド固定アームの位置を確認してください。 ぼろの訓練を受けた動物をラップします。モバイルホームケージに動物を配置します。頭部固定アームに金属ホルダーを固定します。ぼろを削除します。 使用してほこりから注入されたカバーガラスを清掃してください70％エタノール溶液で、それを乾燥させる。 カバークラス上の浸漬液の滴を配置します。水はすぐに蒸発するので、好ましくは、粘性のある溶液を使用しています。 （あなたは、顕微鏡のセットアップで静止している第二に、同一のデバイスを持っていない限り）、顕微鏡下で訓練された動物と、モバイルホームケージデバイスを配置します。 カスタムメイドまたはフェムト秒パルス赤外線レーザを備えた市販のレーザー走査型顕微鏡イメージングシステムのいずれかを使用して撮像を行う。 蛍光顕微鏡の広視野モードを使用して、関心領域を見つける。脳血管系を評価し、血管のパターンを調べた後、適切なターゲット領域を選択するために、長いパスフィルタを使用してください。 画像皮質血管系への、ながら動物はぼろに固定化されている間のどちらか尾静脈に70,000 MWのテキサスレッド結合デキストラン（またはその類似体）の1％溶液を注入、または眼窩動物はホームケージに移動配置される。チューニング860 nmの二光子レーザ出射光を収集するためにバンドパスフィルタ（590-nm）を使用する。 THY1プロモーター下神経細胞の亜集団における感受性蛍光タンパク質GCaMP3 – 、例えば、YFPまたはCa 2 +を発現するトランスジェニックマウスを神経形態や利用ニューロン活動の細部を評価するために515から560 nmの発光フィルターを使用してください。 画像取得のための適切なソフトウェアを使用してください。 画像形成後、ネジを緩めてヘッド固定アームから動物を解放する。そのケージに動物を返し、それが次の撮影セッションを開始する前に少なくとも2時間、休息することができます。 その後の再イメージのために関心領域（ROI）のすべての領域の座標を格納します。画像と同じ時間をかけてのROI、および座標の画像の重なりを最大化するたびに、調整してください。 画像を分析し、適切なSOFTWを使用して3次元再構成を行う（ 例えば 、ImageJは、等）である。 モバイルホームケージの周りを移動覚醒マウスにおける固有の光学イメージング固有の光学イメージングセットアップの画像取得カメラの下、モバイルホームケージを組み立てます。 ぼろの訓練を受けた動物をラップします。モバイルホームケージに動物を配置します。頭部固定アームへの金属ホルダーを固定します。 70％エタノール溶液を使用してほこりから注入されたカバーガラスをきれいにし、それを乾燥させます。 注入されたガラス上グリセロールの低下を置き、8ミリメートルラウンドカバーガラスでそれをカバーしています。 対側感覚毛とは反対の送風管を用いてマニピュレータを配置します。 高速度カメラの位置を調整し、皮質血管系の上に焦点を当てています。 船舶·マップを取得するために、カメラのフィルターなしで緑色光（フィルター546BP30）を使用します。 約400マイクロメートル皮質表面の下に、大脳皮質に深く集中する。 画像Tへ彼の血液酸素化レベル依存性（BOLD）光信号は、カメラの前で590LPフィルターを配置し、赤色光（630BP30フィルター）で皮質を照らす。 それは均等に露出オーバーを回避する、関心領域を介して配信されるように、皮質表面の照明を調整する。関心領域は、カメラのダイナミックレンジ70〜90％のセグメント内に収まるように照度を調整します。 カメラの画像を収集するためにLongDaq画像取得ソフトウェアを使用してください。 低周波数刺激（0.05ヘルツ）での実験のために（1秒当たり10フレームとの間、すなわち 、）1〜10 [Hz]の画像取得周波数を使用する。 本来の光信号との干渉を防ぐために、ルームライトのスイッチを切る。 マウスはモバイルホームケージに適応するために少なくとも30分を許可します。 刺激なしの6分のエピソードの間に画像のベースラインの活動を。 誘発Cを記録するにはortical活動は、高い周波数（25 Hz）の6分の合計期間の空気パフの列と10秒ON/10秒OFFモード（0.05 Hzの刺激）に感覚毛を刺激。 画像取得後は、ヘッド固定アームからマウスを離すとそのケージに戻します。 刺激応答の振幅が対雑音比が優れた信号になり、覚醒動物では比較的高い傾向があるため、周波数の追加データ·フィルタリングを使用しないでください。 画像への*。TIFスタックファイルの取得したセットを変換し、 例えば 、使用してさらにそれらを分析、オープンソースフィジーのソフトウェア（ImageJの）。画像計算ツールを使用して、感覚毛の刺激の間に得られたフレームからベースライン自発的活動を引きます。あるいは、適切なソフトウェアを用いて周波数領域のデータをフィルタ。 モバイルホームケージの周りを移動覚醒マウスにおけるパッチクランプ記録モバイルホームケージを組み立てます。ぼろの訓練を受けた動物をラップします。細菌感染を防ぐためにtrimethoprime（5 mg / kg）をし、スルファド（25 mg / kgの）を管理。モバイルホームケージに動物を配置します。頭部固定アームへの金属ホルダーを固定します。 クリーンおよび70％エタノール溶液または0.5％のグルコン酸クロルヘキシジンを用いて移植歯科用セメント「キャップ」、カバーガラスを殺菌し、乾燥させる。 じっくりと金属ホルダーからカバーガラスを取り外します。 ペニシリン、ストレプトマイシンを補充した皮質のバッファを更新し、滅菌止血タンポンと破片から頭蓋窓を清掃してください。 皮質バッファに接地電極を配置します。 マイクロマニピュレータに電気生理学ヘッドステージに配置します。 6.5から8.5MΩまでの先端抵抗を目指し、ホウケイ酸ガラスからピペットを製作。細胞内液とパッチピペットを埋める。パッチピペット溶液の組成物である（単位：mm）以下の8のKCl、111グルコン酸K、0.5のCaCl 2、2のNaOH、10グルコース、10 HEPES、2のMg-ATPおよび5 BAPTA、pHはKOHで7.2に調整した。膜電位の値は-12 mVで33の計算された液間電位差を補正しなければなりません。 定位座標を用いて、関心領域を対象とし、速やかにピペットチップに強い正の圧力を維持しながら、脳に電極を移動します。 硬膜浸透およびピペット位置決めした後、先端抵抗を測定し、後続のステップの成功率を向上させるために、より多く10〜15％の抵抗増加を示す電極を捨てる。 周囲の脳組織の膨潤を避けるために、半分に正の圧力を低下させる。更なるステップは、標準的な「盲」プロトコルに似ています。から記録するニューロンを見つけるニューロンが近いproximitで検出されるまで、段階的に脳にチップを下げるために電極インピーダンスの特性が変化する時系列で示すように、ピペットチップのY、。ニューロンの存在の重要な指標は、ピペットの複数の連続した​​前進のステップにわたって電極抵抗の単調増加（32μmのステップにわたってピペット抵抗の一般的には、20％増）である。 対象となるニューロンとギガシール接触を形成するために、ピペットの負圧と過分極を適用します。 全細胞構成を確立するために、セルに大きな負圧の短いパルスを印加する。良好なシールを維持するために、2〜3程度で電極を撤回。 所望の期間中に記録自発的または誘発作用、最大20〜40分。 記録した後、脳からピペットを取り外します。 皮質バッファを更新するか、頭蓋窓上のシリコーン接着剤の滴を配置し、金属ホルダーの上に丸いカバーガラスを接着します。 アニムをリリースネジを緩めてヘッド固定アームからアル。次の記録の前に少なくとも1日のケージに動物を返します。 例えば 、FitMasterソフトウェアを使用してデータを分析します。 モバイルホームケージの周りを移動覚醒マウスにおける馴化 – 脱馴化嗅覚テストきれいな綿片（2×2cmに）取り付ける両面テープを使用してモバイルホームケージの壁の内側に水道水に浸漬した。コットン片を「標的ゾーン」の中間に位置するように、壁の外側にカラーマーカを配置することによって、4つのゾーンに移動ホームケージ壁に分割する。 「ターゲット」ゾーンに壁部分の反対に直面してheadh​​olderアームに動物を固定し、それを30分間、モバイルホームケージに適応することができます。 きれいな綿の別の部分を取り、1％のバニラエッセンス数滴とそれを濡らす。 vanilを運ぶ1モバイルホームケージの壁にきれいな綿を交換してくださいLA匂い。 5分間の香りを提示する。匂いの提示期間中にモバイルホームケージの動きを追跡。動物は、モバイルホームケージの移動の合計時間に関連して「ターゲット」ゾーンに直面して費やした累積時間を測定することにより、臭いの関心のレベルを推定する。 5分間のセッション間隔で、バニラの香りを使用して5分​​間のアプリケーションセッションを3回繰り返します。すべてのセッションでは「バニラ」綿の新鮮な一枚を使用してください。 最後の第五のセッション中に、社会的に重要な臭いで動物を提示します。 （反対の性別の動物から、前の日に取得した）尿数滴の綿のきれいな部分を湿らせ、5分間のターゲットゾーンの真ん中に配置します。 モバイルホームケージの周りに起きて、マウスの移動における新しい匂い認識モバイルホームケージ壁の外側にカラーマーカを配置することによって、4つのゾーンに分割する壁。 ATTきれいな綿のach 2個（2×2 cm）を（ターゲットゾーン1及びゾーン2ターゲットとして指定された）互いに対向する区域の中央に壁の内側に水道水に浸漬した。標的ゾーンの外側の壁セグメントに面するheadh​​olderアームに動物を固定し、30分間、モバイルホームケージに適応することを可能にする。 ゾーン1とゾーン2を対象とする水道水で濡れた別のものを対象とする1％のバニラエキスで濡れ場所コットンワンピース匂いの間に10分間のモバイルホームケージの動きを映像を記録します。新鮮なものとの両方の綿の部分を交換してください。プレゼンテーションセッション。動物がターゲットゾーン1に直面している時間の割合として出席臭いを計算する相対累積時間は、ゾーン1と2に直面しました。 10分間隔の後に、その後の10分の期間のためにホームケージの壁にアプリケータの別のペアを配置します。 1％のバナナeでターゲットゾーン1内の「バニラ」コットンと綿棒濡れを配置ターゲットゾーン2内XTRACT。モバイルホームケージの動きを録画してください。動物は、ゾーン1と2が直面する累積時間に対する新規匂い（ターゲットゾーン2）相対で壁セグメントに直面している時間の割合としての新規匂いに優先を計算します。