溶解中にコヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）顕微鏡可視化薬錠

図1。溶解セットアップから本来の流れにCARS顕微鏡のセットアップを模式的に示す。この図は、ファッセルら 13から変更されている。 1。システム起動 20ピコ秒パルス状1064 nmのCARSレーザーをオンにして、レーザー（約1.5時間）ウォームアップすることができます。 重水素ランプ、UV光源をオンにし、それが（約10分）ウォームアップすることができます。 「開放」するシャッタスイッチを設定することにより、重水素ランプ、UV光源のシャッターを開く。 顕微鏡制御用PCの電源を入れ、顕微鏡制御ソフトウェアを起動します。 UV分光計用PCの電源を入れ、分光器制御ソフトウェアを開きます。 2。ミcroscopeセットアップ希望の顕微鏡対物レンズを選択します。本研究で示された結果を達成するために20X/0.5のNA対物レンズを使用してください。 励起レーザを送信し、CARS信号を反射するフィルタセットタレットでフィルタを設定します。この研究で示された結果を複製する775 nmのロングパスダイクロイックミラーと650 nmのバンドパス40 nmのフィルタを選択します。 CARS信号とフィルタの不要な光を透過する光電子増倍管（PMT）検出器の前に置き、適切なフィルター。この研究で行われた実験を再現するために750nmのショートパスフィルタ及び650nmのバンドパス40nmのフィルタを用いて光をフィルタリングする。 3。システムテスト配管から前の液体をクリアするためにZ型のUVフローセルを数分間蠕動ポンプとポンプ溶解媒体をオンにします。 2分でポンプで溶解媒体の量を計量することによりポンプの流量を決定します。ポンプ速度UNを調整ゴマ、所望の流量が達成される。この研究で報告された結果を達成するために、5ml /分の流速で溶出媒体ポンプ。 4。紫外線溶解測定 UV分光計制御用ソフトウェアは、すべての利用可能な分光器が一覧表示されますウィンドウを開くために「新しい吸光度測定」をクリックして「ファイル」メニューをクリックします。 正しいUV分光計をクリックし、[データ収集パラメータを表示するウィンドウを開くには、「次へ」をクリックします。 積分時間とスペクトル平均化の両方を定義します。この研究で示された結果を複製する200平均と150ミリ秒の積分時間を選択してください。 参照スペクトルを記録するために使用される画面を表示し、「次へ」というボタンをクリックしてください。 参照スペクトルを記録する黄色の電球のように表示されるボタンをクリックしてください。この測定中に連続的に溶解媒体をポンピング。 「閉」にスイッチを設定することにより、重水素ランプ、UV光源のシャッターを閉じます。 暗スペクトルを記録するために使用される画面を表示し、「次へ」というボタンをクリックしてください。 暗スペクトルを記録する灰色の電球のように表示されるボタンをクリックしてください。この測定中に連続的に溶解媒体をポンピング。 紫外線吸光度測定を開始するために「終了」というボタンをクリックします。 5。CARS溶解ビデオ 「XYT「測定を選択しボタンをCARS顕微鏡制御ソフトウェアをクリックしてください。 ドロップダウンボックスをクリックして、ピクセル単位で画像サイズを選択します。この研究で報告された画像を再現するために512×512ピクセルの画像サイズを選択します。 「高速」、「中」、または「遅い」の位置のいずれかに画像形成速度スライダをドラッグします。達成するために、高速なスキャン速度（画像ごとに1.12秒）を使用しますこの研究で示された結果。 ズームレベルを調整する「ズーム」と表示された矢印をクリックしてください。ビューのズームとフィールドのレベルを複製するために「2倍」ズームを選択し、これらの結果に使用（350 X 350ミクロン）。 ドロップダウンボックスをクリックし、使用目的を選択します。 入力ボックスをクリックし、（実験の長さに応じて）車の溶解ビデオに必要なフレームの量を入力します。この研究で示された結果を再現するために900フレームを記録することによって、約15分間溶解を行う。 6。CARS波長チューニング光パラメトリック発振器を用いて（OPO）コントローラ所望のラマン周波数で最大レーザ出力に達するまで、温度、ピエゾ位置、リオフィルタ位置としてOPOの設定を調整する。 2960センチメートルにチューニングOPOを-1この記事で紹介したものと同じ結果を記録する。 7。溶解実験カスタム構築されたCARSフローセルの試料ホルダ内に錠剤を置き、試料ホルダは、漏れを防ぐために密閉スクリュー。 CARSは、溶解媒体および蠕動ポンプを入れたビーカーにフローセル接続CARSのフローセルに配管を取り付けます。 顕微鏡ステージ上でタブレットを含むCARSフローセルを配置します。 CARSは、フローセルていることを確認し、溶解媒体ビーカー、蠕動ポンプ、Z字状のUVフローセルおよび廃棄物収集ビーカーに接続されている。 連続スキャンモードで顕微鏡システムのスキャンを開始するには「XYリピート」ボタンをクリックします。 錠剤の表面を顕微鏡制御コンピュータ画面上の視野内になるまで、対物レンズを移動させることにより、顕微鏡の焦点を調整する。 「PMT」と表示され、顕微鏡制御ソフトウェアでスライダーをクリックしてください。 PMTまで電圧を増加/減少することによって検出器の感度を調整する良好な画像を（暗すぎたり、飽和でもない）画面に表示されている。注：高電圧を使用することにより、PMTに過負荷をかけないように注意してください。この作業のために、我々は600 Vの周りにPMT電圧を用いるが、これは使用されるPMTに応じて変えることができる。 連続スキャンを停止するには、顕微鏡制御ソフトウェアで「停止」をクリックしてください。 同時に（あるいは可能な限り一緒に近づけ）溶解媒質をポンピング開始、シングルXYTスキャンの記録を開始し、UV吸収スペクトルの収集を開始。 溶解実験中は、録画を監視し、手動でタブレットにフォーカスが継続的にあることを確認するために顕微鏡の焦点を調整します。 8。ポスト解散電源を切ることによって、蠕動ポンプを停止します。 「ファイル」メニューをクリックして、ビデオなどのスキャンXYTを保存するために、顕微鏡制御ソフトウェアの「ビデオとして保存」をクリックしてください。 「ファイル」メニューをクリックし、「クリック保存」とクリックして "UV吸収スペクトルの収集を停止するように分光器制御ソフトウェアの停止エクスポート」。 CARSは、顕微鏡ステージからフローセル車フローセルから錠剤を削除。 CARSは、水とエタノールを用いてフローセル洗浄し、次いでティッシュペーパーを用いて乾燥させる。