محلل خلية مقرها الممانعة الحقيقي في الوقت كأداة لتحديد المسارات الجزيئية تشارك في العصبية والحمايه العصبيه في خط الخلية العصبية
Summary
Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.
Abstract
العديد من الاضطرابات المرتبطة الدماغ لديهم موت الخلايا العصبية المعنية في الفيزيولوجيا المرضية الخاصة بهم. تحسن في نماذج المختبر لدراسة آثار اعصاب أو عصبية المخدرات ومسارات المصب المعنية من شأنه أن يساعد التبصر في الآليات الجزيئية من العصبية / السمية العصبية ويحتمل تسهيل تطوير الأدوية. ومع ذلك، العديد من المقايسات الموجودة في المختبر سمية لها القيود الرئيسية – الأكثر تقييم السمية العصبية والعصبية عند نقطة زمنية واحدة، وعدم السماح لمراقبة بالطبع الوقت وحركية التأثير. وعلاوة على ذلك، فإن الفرصة لجمع المعلومات عن مسارات الإشارات المشاركة في المصب العصبية في الوقت الحقيقي وتكون ذات أهمية كبيرة. في البروتوكول الحالي وصفنا استخدام الوقت الحقيقي القائم على مقاومة الخلايا محلل لتحديد آثار اعصاب السيروتونين 2A (5-HT 2A) منبهات مستقبلات في خط الخلية العصبية تحت خالية من التسمية والوقت الحقيقي كونديتالأيونات باستخدام قياسات مقاومة. وعلاوة على ذلك، علينا أن نبرهن على مثبطات مسارات الرسول الثانية يمكن أن تستخدم لتحديد جزيئات المصب المشاركة في تأثير اعصاب. وصفنا أيضا فائدة هذه التقنية لتحديد ما إذا كان لها تأثير على تكاثر الخلايا يساهم في التأثير الملحوظ اعصاب. النظام يستخدم لوحات الإلكترونيات الدقيقة الخاصة المشار إليها باسم E-التي تحتوي على لوحات بالتناوب صفائف مسرى مكروي الذهب على السطح السفلي من الآبار، بمثابة أجهزة استشعار الخلية. يتم تعديل قراءات مقاومة من قبل عدد من الخلايا الملتصقة، بقاء الخلية، مورفولوجيا، والتصاق. مشتق معلمة أبعاد يسمى مؤشر الخلية من قياسات المعاوقة الكهربائية ويستخدم لتمثيل الوضع الخلية. عموما، في الوقت الحقيقي القائم على مقاومة الخلايا محلل يسمح في الوقت الحقيقي، وتقييم خالية من التسمية من العصبية والعصبية، وتقييم الثاني تورط مسارات رسول، والمساهمة في المزيدتقييم مفصل والإنتاجية العالية من المركبات اعصاب المحتملة في المختبر، لاختيار المرشحين العلاجي.
Introduction
موت الخلايا العصبية يلعب دورا حاسما في الفيزيولوجيا المرضية من العديد من الاضطرابات المرتبطة الدماغ 1. توافر موثوقة وعالية الإنتاجية في فحوصات المختبر سمية أمر بالغ الأهمية للحصول على فهم أفضل للآليات العصبية وللمساعدة في اختيار جزيئات اعصاب كمرشحين العلاجية في تطوير العقاقير 2. ومع ذلك، هناك العديد من القيود على استخدامها على نطاق واسع في المختبر العصبية assays.They تقييم السمية العصبية / العصبية في وقت واحد نقطة عدم السماح للقرار الحركي. غالبا ما تستخدم التسمية أو التحقيق التي يمكن أن تتداخل مع مسارات الإشارات والحد دراسات إضافية في نفس سكان الخلية، وغالبا ما تكون كثيفة العمالة، وفي كثير من الحالات لا توفر البصيرة الميكانيكية. في هذه الدراسة نحن لشرح فائدة في الوقت الحقيقي القائم على مقاومة الخلايا محلل لتحديد السمية العصبية والعصبية في خط الخلية العصبية في الوقت الحقيقي وتحت خالية من التسميةالظروف وتوفير نظرة ثاقبة آليات المصب من خلال تحليل مسارات الرسول الثانية المشاركة في التنفيذ.
وقد أكدت الدراسات السابقة على صحة محلل خلية في الوقت الحقيقي لتحديد السمية الخلوية وكذلك التأثيرات على تكاثر الخلايا في خطوط الخلايا بالمقارنة مع التقنيات القياسية 3،4،5،6. على سبيل المثال، لوحظ وجود علاقة جيدة بين قراءات من معيار بقاء الخلية WST-1 فحص خلية والقيم مؤشر في عدة نقاط الوقت في ظل ظروف انتشار القاعدية وبعد سنتين نماذج مختلفة السامة في خلايا هيلا 3. في A549 وMDA-MB-231 تكاثر الخلايا وسمية الخلايا أثار مع باكليتاكسيل أنيبيب استقرار أظهرت قيم متشابهة جدا عندما تقدره قياسات مؤشر الخليوي وsulforhodamine تستخدم standardly ب (SRB) فحص 4. في خط الخلية العصبية من الخلايا العصبية قرن آمون خلد تم التحقق من صحة القياسات مؤشر HT-22 الخليوي لقدرتها رس كشف تكاثر الخلايا، الغلوتامات وسمية الخلايا cytoprotection ضد تستخدم على نطاق واسع 3- (4،5-dimethylthiazol-2-YL) 2،5-diphenyltetrazolium الميثيل (MTT) فحص 5. في نفس الدراسة ترتبط نتائج فحص MTT وقياسات مؤشر الخلية بشكل جيد أيضا في قياس انتشار الخلايا الاولية العصبية، السمسة بعد الحرمان عوامل النمو والانقاذ من السمية الخلوية من قبل عموم كاسباس المانع QVD 5. أظهرت سمية الخلايا المستحثة في خلايا NIH 3T3 بواسطة Vandetanib (نمو بطانة الأوعية الدموية ومستقبلات عامل نمو البشرة مستقبلات عامل مثبط) نتائج مماثلة قياس مع قيم مؤشر الخلية أو محايدة امتصاص أحمر فحص 6.
وقد استخدمنا في الآونة الأخيرة في الوقت الحقيقي نظام محلل خلية لتقييم آثار اعصاب من 2A السيروتونين (5-HT 2A) مستقبلات ناهض هيدروكلوريد (±) -2،5-dimethoxy-4-iodoamphetamine (دوى) في خط الخلية العصبية ( خلايا SK-N-SH) وفرزهم لمشاركة SECOالثانية مسارات رسول من خلال رصد تأثير تثبيط الكيميائي على العصبية وحظ 7. ومن المثير للاهتمام، و5-HT 2A مستقبلات لديه منبهات كل من الهلوسة وnonhallucinogenic (مثل دوى ويسوريد، على التوالي)، والتي قد بتنشيط كل مشتركة ومتميزة مسارات الرسول الثانية 8.
مزايا هذه التقنية المقدمة هي أنه يتيح لجمع المعلومات في الوقت الحقيقي على بقاء الخلية خلال أيام، لتحديد مسارات ثاني رسول المعنية، لتقييم مساهمة ممكنة من آثار انتشار إلى العصبية، وتحديد الوقت الأمثل لإجراء دراسات إضافية نقطة النهاية على نفس السكان الخلية. ويرد الرسم التخطيطي لسير العمل في البروتوكول الحالي في الشكل 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم البروتوكول الحالي فائدة محلل خلية في الوقت الحقيقي لتقييم مستمر وتحت ظروف خالية من تسمية / التأثيرات السمية العصبية اعصاب من المركبات في خطوط الخلايا العصبية وإلى التبصر في مسارات الرسول الثانية المشاركة في التنفيذ.
على ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.
We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC – (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| tisue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | automated cell counter |
| phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | for washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294,002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate |
References
- Cavallucci, V., D’Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
- Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , (2007).
- Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
- Kustermann, S., et al. A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
- González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
- Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
- Galante, D., et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).
- Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD. Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).
