JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
면역학 및 감염병학

Kapsüler Serotipleme<em> Streptococcus pneumoniae</em> Lateks Aglutinasyon tarafından

Published: September 25, 2014
doi:
10.3791/51747
, ,
1Pneumococcal Research,Murdoch Childrens Research Institute, 2Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity,The University of Melbourne

Summary

Lateks aglütinasyon testi Streptococcus pneumoniae serotip için, basit, hızlı ve ucuz bir yöntemdir ve aynı zamanda yaygın tanı mikrobiyoloji uygulanmıştır. Bu el yazması lateks aglütinasyon reaktif, kalite kontrol prosedürlerinin içi üretim ve pnömokok serotipleme Bu tekniğin uygulanması anlatılmaktadır.

Abstract

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.

This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (pnömokok) beş yaşın altındaki çocuklarda morbidite ve mortalitenin önemli bir nedeni eski dünya çapında, özellikle kaynak fakir ayarlarında 1,2,. Zatürree, sepsis gibi hayatı tehdit eden durumlara lokalize enfeksiyonlardan Pnömokok hastalığı aralıkları ve 1,2 menenjit.

Pnömokokların fazla 90 serotip tespit onların kapsül polisakkarit 3 farklılıklara dayalı olmuştur. Şu aşılar kapsüler polisakkarit hedef ve invaziv hastalık 4 neden önemli serotipten koruma sağlar. Pnömokok izolatlarının serotiplendirme taşıma ve hastalık üzerine aşılamanın etkisini değerlendirmek yanı sıra geniş epidemiyolojik bilgiler 5,6 sağlanması için önemlidir. Pnömokok tipleme için geçerli 'altın standart' yöntemi kapsül şişme deneyi testi, ama zaman alıcıdır ve perfo bazı beceri gerektirirrm 7. Lateks aglütinasyon Dünya Sağlık Örgütü tarafından 7 alternatif bir serotipleme yöntemdir. Lateks aglütinasyon gerçekleştirmek için hızlı ve basit, ve dünya çapında 8-11 birçok laboratuvarda kullanılmaktadır. Önemli olarak, lateks aglütinasyon pnömokok serotipleme 10,12-14 için kapsül şişme deneyi test etmek için karşılaştırılabilir kesinliği göstermiştir. Genel olarak, bu yöntem, kaynak yoksulluğu yanı sıra yüksek miktarda laboratuarlar için idealdir.

Lateks aglütinasyon reaktifler ('lateks reaktifleri') lateks parçacıkları 15 antikorların bağlanması ile oluşturulur. Pozitif bir reaksiyon olarak, bu etiketlenmiş parçacıklar, spesifik bir antijenin varlığında tutunurlar. Ticari lateks reaktifleri Serotiplerin sınırlı bir aralığı için mevcuttur. Lateks reaktifleri aynı zamanda ticari olarak temin edilebilen anti-serumlar kullanılarak 10 in-house hazırlanabilir. Antiserumlar karışımları ("havuzlar") yanı sıra, pnömokokkal s özgü antiserumlarerogroups (örneğin, grup 19), tek tek serotip (örneğin, serotip 5), ve belirli antijenlere karşı ("faktör", örn., serotip 19A tanıyan faktörü 19c) ayrıca, grup içinde serotipleri tanımlanması için 16 mevcuttur.

Bu yazıda, lateks parçacıkları için ticari olarak temin edilebilen antiserumlar pasif ucunu kullanarak lateks reaktiflerin üretilmesinde adımları açıklamaktadır. Bu yöntemin Kalite kontrol (KK) yönlerini tarif edilmiştir ve pnömokok tipleme için lateks reaktiflerin kullanımı için bir protokol dahildir.

Protocol

Içi Lateks Ayıraçların hazırlanması 1. Glisin tamponlu tuz hazırlanması (GBS) 1.5 g glisin, 11.7 g sodyum klorid ve 200 ml'lik bir cam şişeye damıtılmış su, 100 ml ilave edilir. Manyetik bir karıştırıcı kullanarak çözmek üzere karıştırılır. Bir ölçme silindiri 500 ml karışımı aktarın ve 200 ml lik bir toplam yapmak damıtılmış su ilave edilir. , 200 ml'lik bir cam kaba geri çözeltisini pH'ı kontrol edin ve 5 M sodyum hidroksit ile 8.2 olarak ayarlanır. NOT: Sodyum hidroksit aşındırıcı, kişisel koruyucu ekipman giyin. Filtre 250 ml'lik preautoclaved vidalı kapaklı cam şişeye 0.22 mcM filtreleri ve çok sayıda 60 ml şırınga kullanarak çözüm sterilize. Oda sıcaklığında saklayın. % 0.2 büyükbaş hayvan serum albümini ile GBS hazırlanması 200 ml'lik bir cam kabın, büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) tozunun 0.2 gramı ve GBS 100 ml ilave edilir ve manyetik bir karıştırıcı kullanılarak eritmek için karıştırın. Filtre250 ml'lik bir preautoclaved vida kapaklı bir cam şişeye çok sayıda 60 mi şırıngalar 0.22 uM filtre yoluyla çözeltinin sterilize edin. 4 ° C'de saklayın. Lateks reaktif hazırlama Alt mikrofuge'ye tüp yuvarlak bir 2 ml etiketleyin. Not: tüpler yuvarlak tabanlı bir antikor bağlanmasını etkileyebilir parçacık çökmesini en aza indirmek için kullanılır. Steril uçları işlemi, mikrofüj tüpüne GBS 975 ul ile P1000 pipet kullanarak, daha sonra lateks tepkime maddesi (yani, havuz, grup, tip veya faktör) hazırlanan uygun pnömokok antiserumu 25 ul ekle. Karıştırmak için beş kez ters çevirin. Steril fizyolojik salin 1080 ul lateks partikülleri 120 ul ekleyerek polistiren lateks parçacıkları 1:10 seyreltin. NOT: Bu daha fazla hacimlerde yapılabilir, ancak lateks reaktifler üretilmiş taze her yapılmalıdır. 1 (adım 1.3.3 hazırlanan) 01:10 lateks süspansiyonu 1.000 ul ekleyin,000 ul 1:40 antiserumu süspansiyonu (aşama 1.3.2 hazırlandı). Karıştırmak için beş kez ters çevirin. Yavaş dönen bir tekerlek üzerinde 37 ° C'de inkübe edilir (örneğin, 38.5 cm çapa sahip bir tekerlek için 4 rpm) 2 saat karıştırıldı. 1,100 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı atın ve yavaşça steril tuzlu 2 ml pelletini. 1,100 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı atın ve GBS 1 ml ekleyin ve hafifçe pelletini. Etiketli bir 5 ml lateks süspansiyonu pipetle tüp kapatıldı vida. GBS başka 1 ml ekleyin. GBS (pH 8.2) (adım 1.2 hazırlandı) (ağ / hac)% 0.2 BSA ihtiva eden 2 ml ilave edilir. % 10 bir koruyucu olarak sodyum azid (ağ / hac) çözeltisi 40 ul ekle. NOT: Sodyum azid solunması halinde tehlikeli olduğunu ve bir cilt ve göz tahriş edicidir. Bu inhalasyon yoluyla temas riskini en aza indirir gibi, toz halinde yerine hazırlanmış bir% 10 çözelti satın almak için arzu edilir. Eldiven, bir de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanlar (Bu reaktifi işlerken d gözlüğü) giyilmelidir. Ayrıntılar için Malzeme güvenlik veri sayfasına bakın. 4 ° C'de saklayın lateks reaktif ile gerçekleştirilebilir. Negatif kontrol lateks tepkin maddesi hazırlanması Alt mikrofuge'ye tüp yuvarlak bir 2 ml etiketleyin. Not: tüpler yuvarlak tabanlı bir antikor bağlanmasını etkileyebilir parçacık çökmesini en aza indirmek için kullanılır. Steril uçları işlemi, mikrofüj tüpüne GBS 975 ul ile P1000 pipet kullanarak, daha sonra 25 ul normal tavşan antiserumu ilave edin. Karıştırmak için beş kez ters çevirin. Adımlarda devam yukarıdaki 1.3.10 için 1.3.3 2. Kalite Kontrol Lateks Ayıraçların (QC) Oda sıcaklığına kadar lateks tepkin maddesi getirin. Kullanmadan hemen önce, yavaşça Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek lateks tepkin maddesi karışımı. Bir cam mikroskop lamı üzerine 15 ul pipetleyerek autoagglutination için ayıraç edin ve adımları 4.7 ve aşağıda 4.8 gibi devam edin. Hayır olmalıLateks partiküllerin gglutination. Reaktif beyaz ve pürüzsüz görünmesi gerekir. Düşük geçiş pnömokok izolatı bir paneli karşısında reaktif edin. Izolatların paneli 'hedef' serotipin izolatlarınının (reaktif madde için spesifik serotip test ediliyor) ve 'hedef olmayan' serotiplerini (normalde çapraz olmamalıdır diğer Serotiplerin izolatlarınının içermelidir 3. adımda hazırlanan taze yetiştirilen kültürler kullanın ) tepkin maddesi ile reaksiyona girer. QC geçiren Her bir lateks tepkin maddesi için, her bir hedef ve hedef olmayan serotip en az bir izolat içerir. Serotipte sadece bir hedef ya da hedef olmayan serotip, Test, iki farklı izolat ise. NOT: Test paneli invazif hastalık ve / veya tip kültür koleksiyonlarından nadir bazıları her çeşitli serotip izole, içermelidir. Genellikle (veriler gösterilmemiştir) serotipi için daha fazla çaba gerektirir gibi ve dolayısı ile de gücü o test bazı taşıma izole dahil etmek tercih edilirreaktifler f ve reaktifler invaziv ve taşıyıcısını izolatlarının hem serotiplendirme olası yeteneğine sahip olmasını sağlamak. Hedef ve hedef olmayan pnömokok lateks reaktiflerin Test devam adımları 3 ve 4 de tarif edilen yönteme göre izole edildi. Sonra en az yılda daha sonra üretim zamanı ve kalite kontrol reaktifleri. NOT: Bir reaktif QC geçemezse, toplu atılır ve yeni bir hazırlama yapılmalıdır. Tekrar QC arızası durumunda biz reaktifler Ortika ve ark. 2013 8 ve aşağıdaki tartışmada tarif edilen alternatif yöntemler kullanılarak üretilebilir önerilir. Serotiplemeye Pnömokok Kültürler 3. hazırlanması Steril bir spiral kullanarak pnömokok tek bir koloni seçin Primer inokulum plaka yüzeyinin yaklaşık üçte birini kapsayan ve böylece sağlam bir seçici olmayan kan agara bunu izole ve çizgi. Tek koloniler için Streak. NOT: defibrinleştirilmiş at veya koyun kanından hazırlanan levhalar uygundur; ama insan kanı veya Sitratlı hayvan kanı ile hazırlanan kan plakaları değildir. % 5 CO2 içeren bir atmosferde 37 ° C'de levha O / N inkübe edin. Saflık plaka üzerinde büyüme dikkate ve tipleme için yeterli gelişme olduğunu değerlendirmek. Not: pnömokok izolatı saf bir kültürü tipleme için gereklidir. Levha yüzeyi yaklaşık olarak üçte birini kaplayan deneyim konflüent, veya yapışık yakınındaki büyüme genellikle serotipleme tamamlamak için yeterlidir. Pnömokok kültürler autolysis eğilimli olabileceğinden, tipleme için hazırlanan kültürler altkültür, 24 saat içinde test edilmelidir. Serotipleme başlamadan önce en fazla 15 20 dakika kuluçka kültür plaka almayın. 4. İletken Lateks Aglütinasyon Serotipleme Yaklaşık için oda sıcaklığında bunları buzdolabı tüm reaktifler lateks ayırın ve30 dakika nerdeyse. Kullanmadan hemen önce, yavaşça reaktifleri karıştırmak için tüpler ters. Bir mikroskop lamı etiketleyin. Mikroskop lamı üzerine negatif kontrol lateks reaktifi 15 ul yerleştirin. Döngü yaklaşık yarısı dolu olacak şekilde steril tek kullanımlık 1 ul döngü kullanarak pnömokok kültürünün bir süpürme alır. Hafifçe negatif kontrol lateks tepkime maddesi damla yakın sürgü yüzeyine inokulum smear. Inokulum cam slayt üzerinde görünür olmalıdır. Hızlı ve iyice döngü kullanarak negatif kontrol lateks ayıraç içine inokulum karıştırın. Damla başlangıç ​​boyutundan daha fazla yaymak değil emin olun. Iki ucunda tutarak, slayt Pick up. Ileri ve geri 1 dakika için slayt sallayın. Yavaş yavaş hareket sıvı tutmak ve damla büyüklüğü artmaz emin olmak için özen gösterin. NOT: Alternatif bir tabak rocker kullanın. Makroskopik aglütinasyon (yani, tarafından gözlemlemekçıplak göz) ve siyah bir arka plan karşı süspansiyon takas. Negatif kontrol lateks reaktifi hiçbir aglütinasyonunu gösterir veya takas yukarıdaki adımları 4,1-4,8 olarak negatif kontrol lateks reaktifin test lateks reaktifleri yerine, kültürünü test devam edin. Taze bir döngü, her zaman kullanılmalıdır. Havuzları ile başlayan lateks reaktiflerin test ile devam edin. Bir pozitif test elde edilene kadar arka arkaya 'Havuz' lateks reaktifleri her test edin. NOT:. Örneğin, ilk slaytta üç büyük olasılıkla havuzları için test özellikle serotip (yerel insidansını yansıtmak için 'tur' yapılabilir havuzlarının test sırası bir pozitif reaksiyon elde değilse, o zaman testi ) ve böylece pozitif bir tepki elde edilene kadar, bir sonraki üç ikinci slayt üzerinde kalan havuzları muhtemelen. Bu, en yaygın serotipler gereken zamanı en aza indirmek ve reaktifler, birinci test edilmesini sağlamaktadır. Antiserumlar üreticinin anahtarını kullanarak olumlu havuzunda temsil bireysel hangi antiserumlar belirler. Yukarıdaki adımları 4,1-4,8 olarak "grup" ya da "türü" belirlemek için ayrı ayrı pozitif havuz içinde yer alan bir gruba ya da türlerinin her biri test edin. Antiserumlar üreticinin anahtarına referans ile bu sonuç belirler. Bir 'tür' tespit edilirse (örneğin, serotip 5), daha sonra başka test gerekli ve bu sonuç kaydedilir. 'Grup' tespit edilirse (örneğin, grup 19), daha sonra test edilecek faktörleri belirlemek için üreticilerin anahtarına bakın. Bireysel 'faktörü' lateks reaktifleri ile teste devam ve son serotipik (örneğin, serotip 19B) belirler.

Representative Results

Lateks partikülün tip-spesifik antikor pneumococcus un kapsülünün bağlanır ve buradaki antikor etiketlidir partikülleri aglütinasyonu 15 gelişir olduğunda pozitif bir lateks reaksiyon meydana gelir. Şekil 1A arka görünür aglutinasyon testi ve temizleme ile karakterize edilen bir pozitif reaksiyonunu göstermektedir süspansiyonu. Negatif bir reaksiyon yumuşak ve beyaz (Şekil 1B), kalan lateks aglütinasyon reaktif süspansiyonu ile karakterize edilir. Bir pozitif reaksiyon, bir dakikalık bir zaman süresi içinde (yaklaşık 20 saniye içinde, genellikle tespit edilebilir) sonuna kadar dikkat edilmesi gerektiğini, böylece ayıraçlar optimize edilmiştir. Biz 1 dakikalık bir zaman aralığından sonra tepkilerini okuma önermiyoruz. Çok nadiren, reaksiyonlar arka süspansiyon temizleyerek eşliğinde, ya da hiç plan temizlenmesi ile kılçıklı 'görünmez bir damla kenarında zayıf aglütinasyonunu görüntülemek (veriler gösterilmemiştir). Bunlar çoğu gibi ly olumsuz tepkiler. Bu tür durumlarda, retesting ve / veya başka bir serotip yöntemi (örneğin kapsül şişme deneyi tepkime karışımı 17) ile daha ileri araştırmalar önerilir. Şekil 1. Pozitif ve negatif lateks aglütinasyon reaksiyonları. Bir pnömokok hazırlıklar pozitif reaksiyon (A) veya olumsuz bir tepki (B) gösteren lateks aglütinasyon maddesi ile karıştırılır izolat. Arka temizlenmesi eşlik Yapıştırma .Orada negatif kontrol lateks tepkin maddesi ya da bir negatif test reaksiyonu (B) görünür bir aglütinasyon olan pozitif reaksiyon, (A) olarak görülmektedir. Fotoğraf 8 izni ile kullanılır."Target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Lateks aglütinasyon pnömokok tipleme için basit, hızlı ve ucuz bir yöntemdir. Ticari pnömokok lateks aglütinasyon reaktifler kullanılabilir, ancak şu anda bilinen tüm pnömokok 10,12 serotipleri ayrım yoktur. Ancak, lateks aglütinasyon maddeleri kolayca belirli pnömokok kapsüler antigenlere karşı ortaya çıkan anti-serumlar kullanılarak satın içerisinde imal edilebilir. Burada tarif edilen yönteme göre, antikorlar pasif lateks aglütinasyon reaktif bir set yapmak için lateks parçacıkları eklenir.

Pnömokok polisakkarit kapsül 18,19 izole üzerinde lateks partiküllere bağlı spesifik antikorların antijenlere taktığınızda pozitif lateks bir reaksiyon oluşur. Antikorlara bağlı lateks partikülleri spesifik bir antikor-antijen reaksiyonu, büyütme olmadan gözlemlenmesini sağlar.

Lateks aglütinasyon yüksek kapasiteli laboratuvarlar için uygun bir yöntemdirkaynak fakiri ayarları için de d. Lateks aglütinasyon yöntemi önemli avantajları hiçbir özel ekipman testi gerçekleştirmek için gerekli olduğunu vardır, reaktifler 4 ° C'de 8 de depolandığında en az 2 yıl raf ömrü var ve bu, basit, ucuz ve hızlı olduğunu gerçekleştirmek için. Lateks kümelenme bir pnömokok izolatı serotip yaklaşık 10 dakika sürer, ve dört adete kadar lateks reaktifler, bir slayt üzerinde paralel olarak test edilebilir. Serotiplerin sıklığı önemli bir epidemiyolojik ayarı için bilinen Ayrıca, eğer, deneme testi 17 kapsül şişme deneyi benzer yaygın olan serotipleri içeren havuzlara başlayarak mermi gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım, bir serotip belirlemek için gereken test sayısını en aza indirir. Yöntem ayrıca, farklı operatörler arasında yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu (veriler gösterilmemiştir). Lateks aglütinasyon serotipleme bir dezavantajı, reaktif maddeler üreten yaklaşık 4 saat alarak, zaman tüketen olmasıdır; Birden fazla tepkili olmasına rağmenNTS kolayca paralel olarak üretilebilir. Ayrıca, bazı antijenler, bazı anti-serumlar ile çapraz tepkime ile sonuçlanan farklı pnömokok serotipleri ortak olan (örneğin, serotip 29, 42, Grup 35). (Genellikle daha sorunlu çapraz reaksiyona giren antikorları uzaklaştırmak için absorplanmıştır edilir), ticari antiseranın ve ek reaksiyon tabloları kullanarak mevcut olan serotip ayırt etmek için üretici tarafından sağlanan Ancak, bu çapraz reaksiyonlar iyi karakterize edilir. Antikorlar lateks parçacıkları üzerinde düzgün hizalanmış değilse de geçebilir lateks reaktifleri tepki; Bu QC başarısızlık olarak algılanır. Bizim deneyim, titiz QC piyasada mevcut antiserumlar üretim için kullanıldığında bile, bu yöntemin başarısı için esastır. QC reaktif başına yaklaşık olarak 15 dk ve yukarıda tarif edildiği gibi izole edilen uygun QC bir dizi dayanır.

Burada tarif edilen metot, bir pozitif reaksiyon de wi elde reaktifler ile sonuçlanırtest süresi ince. Bizim tecrübelerimize göre, yanlış pozitif (veriler gösterilmemiştir) pratikte nadirdir. Arasıra yanlış negatif reaksiyonlar gözlenir; Genellikle, bu, belirli bir antiserum ile bilinen sorunlar (örneğin serogrup 6 izolatı Havuz B antiserumu ile reaksiyona girmemekte) veya izolatı ile kapsül ekspresyonunun aşağı regülasyonu ile ilgilidir. Yanlış pozitif veya negatif reaksiyon, bir kör uç 'sonucu verir çoğu durumda imalatçı tarafından sağlanan serotip algrorithm kullanılması da önemlidir. Reaksiyonları yorumlamak zor olduğunda bu gibi durumlarda, ve biz bu kapsül şişme deneyi reaksiyonu gibi alternatif bir yöntemle tekrar-test ve / veya testini öneririz.

Bazı sorun giderme bazen tatmin edici lateks reaktifleri yapmak için gereklidir. Burada açıklanan yöntem, antikor pasif adsorpsiyon 15,19 ile, lateks parçacıkları bağlanmış, böylece kritik bir değişkendir kadar iyi belirler ikinci antikor konsantrasyonu, birLateks partiküllerin yüzeyi kapalı ve antikor, aktif alanlarının 15,20 sonraki hizalamasıdır. Yetersiz veya aşırı antikor, lateks partiküllerin de bağlı olduğu Sonuç olarak, eğer, antikor-antijen reaksiyonu optimum olmaz ve tatmin edici reaktifler 15,20,21 üretilebilir. Antikor titreleri antiserumların farklı partiler arasında değişir gibi, dilüsyonlarının standart bir dizi kuyu 8 gerçekleştirmek reaktifler üretmek olmayabilir. Yararlı bir başlangıç ​​noktası antiserumun bir 1:40 seyreltme kullanımı ve bu başarılı değilse, daha da antiserumu seyreltin. Bizim tecrübelerimize göre bu genellikle sorunu 8 giderir. Vakaların küçük bir sayıdaki belirteçler hedef izolatları ile test edildiğinde süspansiyon takas eşlik etmediği zayıf aglütinasyon gösterebilir. Reaktifin kalitesini geliştirmek değil, ama tatmin edici reaktifler genellikle santrifüj ihmal ederek üretilebilir ve yıkama adımları 8,22 antiserumu seyreltilmesi Bu durumda </sup>.

Antikor kaplı lateks parçacıkları çok farklı mikropların 15,20 tespiti, kimlik veya tipleme için tanısal mikrobiyoloji yaygın kullanılmaktadır. Bu nedenle, burada tarif edilen yöntem, diğer amaçlar için lateks tepkin maddeleri hazırlamak için uygun olabilir, Resim uygun antiserumlar kullanılabilir ve yeterli kalite kontrol prosedürleri kabul edilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Microparticles based on polystyrene, 800 nm Sigma 65984-10 ml-F Or other volumes as required
Normal rabbit serum Antibodies Australia  NRS-1ml Or other volumes as required, bring to room temperature before use
Pneumococcus (Neufeld) antisera SSI Diagnostica Various Bring to room temperature before use
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Sterile Bovine Albumin  Sigma A-4503 Bring to room temperature before use
Sodium azide 10% (v/v) solution  VWR International ROAC3902/100ml Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml Eppendorf 0030 120.094 Round bottom
Sodium chloride Merck 10241.AP
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl Copan CD175SO1
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm Thermo Fisher Scientific LBS 2950RC
5 M NaOH BDH 10252 Caution: highly corrosive
Glycine Merck 10119.05
Horse Blood Agar (HBA) plates Thermo Fisher Scientific PP2001 Bring to room temperature before use
http://www.thermofisher.com.au
Rotating wheel Wyble Engineering Development Corporation Not available
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml Technoplas S5016SU
60 ml syringes without needles Terumo SS-60L
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RS
Brochure on Neufeld antisera Statens Serum Institut Key to determining serotypes
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Key to pneumococcal factor serum Statens Serum Institut 18058 For determining serotype within Groups
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
*alternative sources are available for most materials
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudan, I., et al. Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries. J Glob Health. 3 (10401), (2013).
  2. O’Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  3. Henrichsen, J. Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).
  4. Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).
  5. Mulholland, K., Satzke, C. Serotype replacement after pneumococcal vaccination. Lancet. 379, 1388-1389 (2012).
  6. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, 1962-1973 (2011).
  7. Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine. , (2013).
  8. Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping. BMC Res Notes. 6 (49), (2013).
  9. Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).
  10. Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex). J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).
  11. Turner, P., et al. Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray. J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).
  12. Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae. J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).
  13. Lalitha, M. K., et al. Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries. Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).
  14. Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates. J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).
  15. Gella, F., Serra, J., Gener, J. Latex agglutination procedures in immunodiagnosis. Pure Appl Chem. 63, 1131-1134 (1991).
  16. Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction. J. Vis. Exp. (84), (2014).
  17. Arai, S., et al. Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae. Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).
  18. Lafong, A. C., Crothers, E. Simple latex agglutination method for typing pneumococci. J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).
  19. Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests. J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).
  20. Yap, K. L. Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection. Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).
  21. Severin, W. P. Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis. J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).

Tags

Streptococcus PneumoniaePneumococcusCapsular SerotypingLatex AgglutinationQuellung TestMicrobial DiagnosisIdentificationEpidemiologyVaccination ImpactResource-poor SettingsHigh-volume WorkloadsIn-house ProductionQuality Control

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Porter, B. D., Ortika, B. D., Satzke, C. Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination. J. Vis. Exp. (91), e51747, doi:10.3791/51747 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image