Marqueur de surface cellulaire Purification médiation de iPS intermédiaires cellulaires à partir d'un modèle reprogrammable souris

1 Instrument Settings / Préparation des réactifs / Génotypage Préparer le milieu de cellules iPS: Supplément de 500 ml Knockout milieu DMEM avec du sérum 75 ml fœtal bovin (FBS), 5 ml de L-glutamine, 5 ml acides aminés non essentiels, 500 pi β-mercaptoéthanol, 5 x 10 5 unités leucémie facteur inhibiteur ( FRV). S'il vous plaît se référer à la liste des matériaux pour le produit et les informations d'achat pour les réactifs utilisés dans le cadre de ce manuscrit. Préparer le milieu MEF: Supplément de 500 ml du milieu DMEM avec 50 ml de FBS, 5 ml de L-glutamine, 5 ml acides aminés non essentiels, 5 ml de pyruvate de sodium, 500 pi β-mercaptoéthanol. Préparer le milieu de congélation: Pour 10 ml, mélanger 9 ml de FBS avec 1 ml de DMSO. Préparer la gélatine enduite plats Ajouter une solution de gélatine porcine 5.3 ml à 0,1% pour un flacon T75, incuber à température ambiante pendant au moins 10 min et aspirer juste avant utilisation. Préparer milieu de marquage FACS: Pour 10 ml, mélanger 9,9 ml de PBS avec 0,1 ml de FBS. Effectuerun génotypage par PCR pour le locus Rosa26 m2rtTA: Effectuer des réactions avec l'ADN polymérase Taq selon les instructions du fabricant. Utilisez une modification de MgCl2 -concentration de 3,5 mM et les trois amorces suivantes: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3 '. Les conditions de cyclage: 94 ° C pendant 3 min; 35 cycles de (94 ° C pendant 30 sec, 65 ° C pendant 1 min, 72 ° C pendant 1 min); 72 ° C pendant 2 min; maintenir à 12 ° C. La taille du produit attendu: 650 pb pour l'allèle sauvage et 340 pb pour l'allèle mutant. Effectuez une PCR génotypage du locus collagène StemCa / OKSM: Effectuer des réactions avec l'ADN polymérase Taq selon les instructions. Utilisez une modification de MgCl2 -concentration de 2,5 mM et les trois amorces suivantes: col / frt-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Les conditions de cyclage: 95 ° C pendant 1 min: 2 cycles de (94 ° C pendant 30 sec, 70 ° C pendant 45 s), 6 cycles de (94 ° C pendant 30 sec, 68 ° C pendant 45 s) et 30 cycles de (94 ° C pendant 20 s, 60 ° C pendant 1 min); 72 ° C pendant 5 min; maintenir à 12 ° C. La taille du produit attendu: 331 pb pour l'allèle sauvage et 551 pb pour l'allèle mutant. Effectuer toutes les étapes de centrifugation à 400 g pendant 3 min à 4 ° C. 2. génération de fibroblastes embryonnaires de souris Effectuer un calage entre l'accouplement d'un animal de la souche OKSM avec un membre du sexe opposé de la souche m2rtTA. Embryons de récolte au jour embryonnaire 13,5 par l'abattage de la mère et de retirer la corne utérine. Avant l'enlèvement de la corne utérine, de pulvérisation de la région abdominale avec une solution d'éthanol à 80%, pour éviter une contamination microbienne. Transférer la corne de l'utérus dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm contenant 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS). Utilisez des ciseaux de qualité chirurgicale stérilisés pour couper la corne utérine en morceaux contenant un embryon (voir la figure 3A, B). Utiliser un microscope de dissection (idéalement placé au sein d'une culture capot de tissus) et des pinces stérilisées à retirer soigneusement l'enveloppe de l'utérus et les membranes extra-embryonnaires entourant chaque embryon. Transférer chaque embryon à une boîte de 10 cm séparée avec 10 ml de PBS. Procédez en supprimant la tête de l'embryon, les membres, la queue et les organes internes (coeur, foie, intestin etc) avec la pince (voir la figure 3C). Transférer la tête de l'embryon dans un tube de 1,5 ml et congeler le bas de sorte qu'il peut être utilisé pour le génotypage si nécessaire. Transférer le torse de l'embryon dans un 10cm assiette vide et utiliser deux lames chirurgicales pour hacher l'embryon pendant 2 min. Ajouter 200 ul de solution de trypsine / EDTA au-dessus de l'embryon hachées et incuber pendant 3-5 min à température ambiante. Continuer hachage pour 2 min, ajouter 2 ml de milieu MEF à l' activer la trypsine, puis les transférer dans un tube de 15 ml. Utiliser une pipette de 1000 pi de dissocier davantage mécaniquement le tissu léger pipetage. Transfert à une gélatine recouvert de 10 cm et d'ajouter un montant supplémentaire de 10 ml de milieu MEF. Remarque: Les deux incubateurs normoxiques et hypoxiques peuvent être utilisés pour la culture, se réfèrent à la discussion pour plus d'informations. Après 24-48 heures, la plaque doit être densément couvert MEF. Alternativement, les cellules peuvent ensuite être propagées ou congelées. Pour la congélation de cellules, retirez le support de culture, rincer le plat avec 10 ml de PBS pour éliminer les traces de médias et de superposition avec 3 ml de trypsine solution / EDTA. Incuber pendant 3 à 5 min à 37 ° C, l'inactivation de la trypsine digestion en ajoutant 5 ml de milieu et de transfert MEF à un tube de 15 ml de centrifugation. Isoler et remettre en suspension le culot dans 3 ml de gel médias. Transfert à 3 cryotubes et congeler dans un récipient de congélation de cellules. 3. reprogrammation de MEF ove_content "> NOTE: cellules pellets par centrifugation à 200 g pendant 5 min à 4 ° C et utiliser normoxiques incubateurs de culture de tissus pour la reprogrammation Il peut être bénéfique de tirer et d'élargir MEF dans des conditions hypoxiques (5% d'oxygène, voir la discussion pour plus d'informations. ). Décongeler rapidement un cryovial faible passage (P0-P1, 2-3 cellules Mio) dans un bain d'eau (37 ° C) et transférer le contenu dans un tube de 10 ml de milieu MEF préchauffées. Cellules à granules, remettre en suspension dans les médias MEF 12 ml fraîches, transférer dans un récipient de culture T75 de gélatine appliquée, et permettent aux cellules de récupérer pendant 24-48 heures avant de continuer. Remarque: MEF peuvent également être utilisées directement après dérivation. Après l'élimination du milieu de culture, le lavage avec du PBS et les MEF cellularize par superposition avec une solution de trypsine / EDTA (3 ml de 3-5 min à 37 ° C). Étancher la trypsine en ajoutant 5 ml de milieu MEF et dissocier en outre des cellules par un mélange doux avec une pipette de 10 ml. Déterminer le nombre de cellules en utilisant un hématimètre. Pour reprograexpériences mming, MEF de semences SUR DES gélatine enduit flacons T75 à des densités de 6,7 x 10 3 cellules / cm 2 (~ 0,5 Mio cellules par flacon) dans les médias iPSC contenant 2 pg / ml de doxycycline. Reportez-vous au tableau 1 concernant les recommandations de semis pour obtenir environ 2 Mio intermédiaires de reprogrammation pour chaque point de temps. Remarque: La reprogrammation commence avec l'addition de doxycycline (2 pg / ml) additionné médias Pour les 6 premiers jours remplacent les médias tous les jours avec de la doxycycline frais complété médias iPSC (12 ml de milieu par flacon T75). Au-delà de ce point renouveler multimédia sur une base quotidienne s'il existe un grand nombre de cellules. Doubler le volume de la culture si les changements de supports ne peuvent être effectuées tous les deux jours. Intermédiaires de récolte de reprogrammation aux points de temps requis (suggestion: Jours 3, 6, 9, 12) en supprimant les médias, le rinçage avec un volume approprié de PBS (10 ml pour un flacon T75) et recouvrant avec une solution de trypsine-EDTA (3 ml pour un flacon T75). Incuberpour 3-5 min à 37 ° C et éteindre en ajoutant 5 ml d'iPSC médias suivis par pipetage doux. Comptez suspension de cellules avec un hémocytomètre (voir ci-dessus), culot par centrifugation, aspirer les cellules surnageant et remettre en suspension dans 10 ml de PBS pour éliminer toute trace de la trypsine. Pellet les cellules une fois de plus, aspirer le surnageant et passez à l'étape 4.1 pour isoler les intermédiaires de reprogrammation. Remarque: Les cellules subissant reprogrammation peuvent être cryoconservés et décongelés pour FACS isolement à un stade ultérieur. Pour établir iPS cultures entièrement reprogrammées, cultiver des cellules en libre-dox iPSC médias pour une période de 4-7 jours. Remarque: les cultures de reprogrammation succès contiennent un grand nombre de colonies par jour 12 (voir Figure 4). Pendant ce temps, les cellules iPS aberrantes qui nécessitent encore l'expression OKSM disparaîtront. Sinon, pour propager les autres entièrement reprogrammées iPS cultures: d'abord, les semences MEF irradiés à une densité de 15 x 10 3 cellules / cm 2 </sjusqu'à> dans 12 ml d'iPSC support sur un enduit de gélatine T75 ballon d'un jour ou 6 heures avant les expériences. Ensuite, cellularize cultures de cellules iPS en supprimant les médias, le rinçage du flacon T75 avec 10 ml de PBS, la superposition avec 3 ml de solution de trypsine-EDTA et incubation pendant 3 à 5 min à 37 ° C. Étancher la trypsine en ajoutant 5 ml de milieu iPSC suivis par un mélange doux, transférer dans un tube conique de 15 ml, centrifuger, puis remis en suspension dans 10 ml iPS médias. Transférer 500 ul de cette suspension cellulaire sur les FAE irradiés (flacon T75) et de permettre aux cultures de se développer pendant 4-5 jours. Remarque: iPS établies cultures peuvent être cryoconservés ou utilisés pour des expériences. Les lignées cellulaires clonales sont obtenues par prélèvement de colonies individuelles iPSC sous un microscope de dissection 22. Cryo préserver les cultures confluentes iPSC comme décrit à la section 2.8 pour MEF. 4. Anticorps étiquetage Remettre en suspension les culots de cellules de cultures de reprogrammation, tels que préparés à la section 3, dansFACS support d'étiquetage complété avec des anticorps (anti-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, anti-SSEA-1 biotine 1: 400 et anti-EpCam Fitc 1: 400). Utilisez 200 pi de mélange complété d'étiquetage par 5 millions de cellules et incuber sur de la glace. Après 10 min tapotez doucement le tube pour remettre en suspension les cellules et incuber pendant 10 minutes de plus sur la glace. Ajouter 10 ml de PBS froid par tube et centrifuger. Pour chaque tube à teindre préparer 200 pi de support d'étiquetage complété avec 1 pi de streptavidine PeCy7 (1: 200) par 5 millions de cellules. Lorsque les cellules ont granulés, aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension dans un volume approprié de support d'étiquetage complétées par streptavidine-PeCy7. Gardez cellules sur de la glace pendant 10 minutes, appuyez sur pour remettre en suspension, incuber pendant 10 minutes sur la glace, ajouter 10 ml de PBS froid par tube, un spin et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les culots cellulaires dans des milieux complétés de marquage l'iodure de propidium (PI) (2 pg / ml) à environ 1 x 10 7 cellules / ml. Retirer amas de cellules en faisant passer la suspension à travers un tamis de 70 um. Transférer les cellules dans un tube FACS appropriée et de les garder sur la glace. Préparer les échantillons séparés avec les différents anticorps (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 et anti-EpCam). NOTE: Ce sont nécessaires pour effectuer une compensation de la couleur dans les trois canaux utilisés dans l'analyse. En outre, les cellules non marquées sont nécessaires pour établir des tensions et des portes pour le tri. Idéalement cellules iPS sont utilisés pour la compensation: les stocks de 0,5-1 x 10 6 cellules iPS entretenus sur MEF irradiés sont stockés dans des cryotubes dans l'azote liquide. La présence de MEF est essentiel pour obtenir un signal dans le canal Thy-1.2. Décongeler un tube cryogénique des cellules iPS comme décrit pour les FAE (section 3). Après la centrifugation, remettre les cellules dans 800 ul de tampon de marquage et 200 ul de cet échantillon est mis de côté en tant que témoin non marqué. Utilisez les cellules restantes en tant que témoins de rémunération. cellules Diviser entre trois tubes de 15 ml et ajouter anticorpscomme suit: Pacific Blue commande de compensation: ajouter 0,5 pi de l'anticorps anti-Thy-1.2 Pacific Blue. Tube de compensation Fitc: ajouter 0,5 pi de l'anticorps anti-EpCAM-FITC. Pe-Cy7 commande de compensation: 0,5 pi de l'anticorps anti AESS-1-biotine. Conserver les échantillons de cellules-anticorps sur la glace pendant 10 min, mélanger en tapotant et incuber pendant 10 min sur la glace. Échantillons lavage avec 10 ml de PBS froid pour éliminer les anticorps non liés, tournent cellules vers le bas et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les culots cellulaires dans 200 pl de substrat d'étiquetage FACS. Pour les anti-SSEA-1-biotine échantillons marqués, ajouter un conjugué streptavidine-PeCy7 (1 pi par 200 pi de cellules). cellules d'étiquetage tels que décrits pour l'anticorps primaire (AESS-1-biotine). Faire passer tous les échantillons y compris le contrôle non marqué à travers un tamis de 70 um et ajouter PI (2 pg / ml). Transférer les cellules dans des tubes FACS et garder sur la glace jusqu'à ce que nécessaire. 5 FACS isolement d'intermédiaires Remarque:Les cellules sont triées à l'aide d'une fluorescence Activé Cell Sorter avec 405 nm, 488 nm et 560 nm lasers d'excitation et une buse de 100 um. Mettre en place des tensions de diffusion vers l'avant et sur le côté de sorte que la population de cellules est visualisée correctement. Dessiner une grille autour des cellules, comme indiqué sur la figure 5A pour exclure les débris. Remarque: La bonne mise en place de tensions sur le trieur de cellules peut être complexe et nécessite un opérateur expérimenté FACS. Utilisez diffusion vers l'avant (FSC) de hauteur par rapport à la zone CFA d'exclure agrégats (Figure 5B). Visualisez la chaîne de PI en fonction de FSC à porte dans les PI cellules vivantes négatifs (figure 5C). Utilisez les cellules non marquées pour régler les tensions pour les canaux de fluorescence de PB, Fitc / GFP, Pe-Cy7. Idéalement positionner la population de cellules à l'extrémité inférieure du canal respectif. Set portes avec des cellules témoins non marqués comme le montre la figure 6A, B à la sous-fraction de culte de reprogrammationures en jour 3, 6 et 9 populations: l'AESS-1-/ Thy-1.2 + cellules; AESS-1 / Thy-1.2- cellules; et la reprogrammation d'intermédiaire pour l'AESS-1 + / Thy-1.2- cellules. Subdiviser la Journée 9 AESS-1 + / Thy-1.2-fraction en utilisant le Pe-Cy7 contre Fitc blot; établir des barrières autour du Sse-a1 + / EpCam + cellules et les cellules de l'AESS-1 + / Epcam-. Set portes avec des cellules témoins non marqués comme le montre la figure 6C, D. Pré-remplir des tubes de collecte appropriés avec les médias de cellules iPS (1-2 ml) avant de trier les sous-populations souhaitées (voir Figure 7 pour les profils FACS représentatifs des MEF, Jour 3 / Jour 6 / Jour 9 / Jour 12 cultures et des cellules iPS). Effectuer FACS tri selon fabrique protocole. Après FACS isolement soumettre les cellules à un profilage moléculaire (ARN / extraction de protéines, immunoprécipitation de la chromatine, l'ADN méthylome analyse etc). En variante, les différentes fractions cellulaires peuvent être mises en culture.