Celoppervlaktemerker Mediated Zuivering van iPS Cell Intermediates van een Herprogrammeerbare muismodel

1 Instrument instellingen / Bereiding van het reagens / Genotyping Bereid iPS celmedium: Supplement 500 ml Knockout DMEM medium met 75 ml foetaal runderserum (FBS), 5 ml L-glutamine, 5 ml niet-essentiële aminozuren, 500 ul β-mercaptoethanol, 5 x 10 5 stuks Leukemie remmende factor ( LIF). Verwijzen wij u naar Materialen Lijst voor product en informatie over de aanschaf van gebruikte reagentia in het kader van dit manuscript. Bereid MEF medium: Supplement 500 ml DMEM medium met 50 ml FBS, 5 ml L-glutamine, 5 ml niet-essentiële aminozuren, 5 ml natrium pyruvaat, 500 ul β-Mercaptoethanol. Bereid invriesmedium: voor 10 ml, combineer 9 ml FBS met 1 ml DMSO. Bereid gelatine beklede schotels Opslaan 3-5 ml 0,1% varkensgelatine oplossing voor een T75 kolf geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 min en zuig vlak voor gebruik. Bereid FACS labeling medium: voor 10 ml, combineren 9,9 ml PBS met 0,1 ml FBS. Voereneen genotypering PCR voor de Rosa26 m2rtTA locus: Voer reacties met Taq DNA polymerase volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik een aangepaste MgCl2-concentratie van 3,5 mM en de volgende 3 primers: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3 '. Cycling omstandigheden: 94 ° C gedurende 3 min; 35 cycli van (94 ° C gedurende 30 seconden, 65 ° C gedurende 1 min, 72 ° C gedurende 1 min); 72 ° C gedurende 2 min; houden op 12 ° C. Verwachte product grootte: 650 bp voor wild-type allel en 340 bp voor het mutante allel. Voer een genotypering PCR voor de collageen-StemCa / OKSM locus: Voer reacties met Taq DNA polymerase volgens de instructies. Gebruik een gemodificeerde MgCl2-concentratie van 2,5 mM en de volgende primers 3: col / FRT-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Cycling omstandigheden: 95 ° C gedurende 1 min: 2 cycli van (94 ° C gedurende 30 seconden, 70 ° C gedurende 45 seconden), 6 cycli (94 ° C gedurende 30 seconden, 68 ° C gedurende 45 seconden) en 30 cycli van (94 ° C gedurende 20 seconden, 60 ° C gedurende 1 min); 72 ° C gedurende 5 min; houden op 12 ° C. Verwachte product grootte: 331 bp voor wild-type allel en 551 bp voor het mutante allel. Voer alle centrifugatiestappen bij 400 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. 2 Generatie van muis embryonale fibroblasten Voer een getimede paring tussen een dier van de OKSM stam met een lid van het andere geslacht van de m2rtTA stam. Harvest embryo's op embryonale dag 13,5 bij het ruimen van de moeder en het verwijderen van de baarmoeder hoorn. Voorafgaand aan verwijdering van de baarmoeder hoorn, spuit de buikstreek met een 80% ethanoloplossing, microbiële contaminatie te voorkomen. Breng de baarmoeder hoorn een 10 cm weefselkweek schotel met 10 ml steriel fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Gebruik gesteriliseerd chirurgische kwaliteit schaar om de uterushoorn in stukken met een embryo (zie figuur 3A, B). Gebruik een dissectie microscoop (ideaal gelegen op een weefselkweek kap) en gesteriliseerde tang om voorzichtig te verwijderen van de baarmoeder envelop en de extra-embryonale vliezen rond elk embryo. Breng elk embryo een afzonderlijk 10 cm schaal met 10 ml PBS. Ga door verwijderen van de embryo hoofd, ledematen, staart en inwendige organen (hart, lever, darm etc.) met de tang (zie figuur 3C). Breng het hoofd van de embryo's in een 1,5 ml buis en vries beneden zodat het kan worden gebruikt voor genotypering indien nodig. Transfer romp van de embryo's in een lege 10cm plaat en maken gebruik van twee chirurgische mesjes voor het embryo blad voor de mond gedurende 2 minuten. Voeg 200 ul trypsine / EDTA oplossing bovenop het gehakte embryo en incubeer gedurende 3-5 minuten bij kamertemperatuur. Verder hakken eens 2 minuten, voeg 2 ml MEF media in activeren trypsine, en vervolgens over te dragen in een 15 ml buis. Gebruik een pipet 1.000 III verder mechanisch dissociëren het weefsel door voorzichtig pipetteren. Over te dragen aan een gelatine gecoate 10 cm schotel en voeg een extra 10 ml van MEF media. Opmerking: Zowel normoxische en hypoxische incubators kan gebruikt worden voor cultuur, zie discussie voor meer informatie. Na 24-48 uur de plaat dicht moet worden bedekt met MEFs. Alternatief kunnen de cellen dan worden verder vermeerderd of beneden bevroren. Voor het invriezen van cellen, verwijder de cultuur media, spoel de schaal met 10 ml PBS om sporen van media en overlay verwijderen met 3 ml trypsine / EDTA-oplossing. Incubeer gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C, inactiveren trypsine digestie door het toevoegen van 5 ml van MEF media en overbrengen in een 15 ml centrifugebuis. Spin down en resuspendeer de pellet in 3 ml bevriezing media. Transfer naar 3 cryovials en neer te bevriezen in een cel bevriezing container. 3 herprogrammeren van MEF ove_content "> NB: Pellet cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en gebruik normoxische weefselkweek incubators voor herprogrammering Het kan gunstig zijn om afleiden en vergroten MEFs onder hypoxische omstandigheden (5% zuurstof, zie bespreking voor meer gegevens. ). Snel ontdooien lage passage cryovial (P0-P1, 2-3 miljoen cellen) in een waterbad (37 ° C) en breng het in een buis met 10 ml voorverwarmde MEF media. Pellet cellen, resuspendeer in 12 ml verse MEF media, over in een gelatine gecoate T75 cultuur vat, en laat de cellen om te herstellen voor 24-48 uur voordat u verder gaat. Opmerking: MEF kan ook direct na afleiding worden gebruikt. Na verwijdering van kweekmedia, wassen MEFs met PBS en cellularize door bedekken met een trypsine / EDTA-oplossing (3 ml gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C). Quench trypsine door toevoeging van 5 ml van MEF media en cellen verder dissociëren door voorzichtig mengen met een pipet 10 ml. Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer. Voor reprogramming experimenten zaad MEFs op gelatine beklede T75 kolven bij dichtheden van 6,7 x 10 3 cellen / cm 2 (~ 0.5 miljoen cellen per kolf) in iPSC media die 2 ug / ml doxycycline. Zie tabel 1 betrekking seeding aanbevelingen circa 2 miljoen herprogrammering tussenproducten voor elk tijdstip te verkrijgen. Opmerking: herprogrammeren begint met de toevoeging van doxycycline (2 ug / ml) aangevuld medium Voor de eerste 6 dagen vervangen media elke dag vers doxycycline iPSC aangevuld medium (12 ml medium per T75 fles). Voorbij dit punt media verlengen dagelijks als er hoge celaantallen. Het dubbele van het volume van de cultuur als media veranderingen slechts om de andere dag kan worden uitgevoerd. Oogst herprogrammering tussenproducten op de vereiste tijdstippen (suggestie: Dagen 3, 6, 9, 12) door media, spoelen met geschikt volume PBS (10 ml voor een T75 kolf) en bedekken met trypsine-EDTA-oplossing (3 ml van een T75 fles). Incubategedurende 3-5 minuten bij 37 ° C en doven door het toevoegen van 5 ml iPSC media gevolgd door voorzichtig pipetteren. Telling celsuspensie met een hemocytometer (zie hierboven), pellet door centrifugeren, zuig de supernatant en resuspendeer cellen in 10 ml PBS om alle sporen van trypsine te verwijderen. Pellet cellen opnieuw, aspireren supernatant en ga verder met stap 4.1 van de herprogrammering tussenproducten isoleren. Opmerking: Cellen ondergaan herprogrammering kan gecryopreserveerd en ontdooid FACS isolatie in een later stadium. Om volledig geherprogrammeerd iPS culturen te vestigen, groeien cellen in-DOX gratis iPSC media voor een verdere 4-7 dagen. Opmerking: herprogrammeren succesvol kweken wordt een groot aantal kolonies op dag 12 bevatten (zie figuur 4). Gedurende deze tijd zal afwijkende iPS cellen die moeten nog OKSM uitdrukking verdwijnen. Als alternatief voor de resterende volledig geherprogrammeerd iPS culturen uitdragen: aanvankelijk, zaad bestraalde MEF bij een dichtheid van 15 x 10 3 cellen / cm 2 </sinschrijven> in 12 ml van iPSC media op een gelatine gecoate T75 kolf op een dag of 6 uur voorafgaand aan de experimenten. Vervolgens cellularize iPS celculturen door het verwijderen van media, spoelen de T75 kolf met 10 ml PBS, bedekken met 3 ml trypsine-EDTA-oplossing en incuberen gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C. Quench trypsine door toevoeging van 5 ml iPSC media gevolgd door voorzichtig mengen, overbrengen naar een 15 ml conische buis, draai af en vervolgens geresuspendeerd in 10 ml iPS media. Breng 500 pi van de celsuspensie op de bestraalde MEF (T75 fles) en laat de kweken groeien gedurende 4-5 dagen. Opmerking: Gevestigde iPS culturen kunnen gecryoconserveerd of worden gebruikt voor experimenten. Klonale cellijnen kunnen worden verkregen door het uitkiezen iPSC individuele kolonies onder een stereomicroscoop 22. Cryo behouden samenvloeiende iPSC culturen, zoals beschreven in 2.8 voor MEF. 4 Antibody Labeling Resuspendeer celpellets van herprogrammering culturen, zoals bereid in paragraaf 3, inFACS labeling medium aangevuld met antilichamen (anti-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, anti-SSEA-1 biotine 1: 400 en anti-EpCAM Fitc 1: 400). Gebruik 200 ul aangevuld etikettering mix per 5.000.000 cellen en incubeer op ijs. Na 10 min tik zachtjes de buis om de cellen te resuspenderen en incubeer gedurende een extra 10 minuten op ijs. Voeg 10 ml koud PBS per buis en spin down. Voor elke buis te worden gemerkt bereiden 200 ui labeling medium aangevuld met 1 ul streptavidine-PeCy7 (1: 200) per 5.000.000 cellen. Wanneer cellen gepelleteerd voorzichtig zuig het supernatant en resuspendeer in een geschikt volume van labeling medium aangevuld met Streptavidine-PeCy7. Houd cellen op ijs gedurende 10 minuten, tikt u op om mengen, incubeer gedurende nog eens 10 minuten op ijs, voeg 10 ml koud PBS per buis, spin down en zuig supernatant. Resuspendeer celpellets in labeling media gesupplementeerd met propidium jodide (PI) (2 ug / ml) bij ongeveer 1 x 10 7 cellen / ml. Verwijder celklonten door het passeren van de suspensie door een 70 pm zeef. Transfer cellen om een ​​geschikte FACS buis en bewaar ze op ijs. Maak afzonderlijke monsters met afzonderlijke antilichamen (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 en anti-EpCAM). OPMERKING: Deze zijn nodig om de kleur compensatie in de drie kanalen gebruikt in de analyses uit te voeren. Bovendien zijn ongelabelde cellen nodig om spanningen en poorten voor het sorteren. Idealiter iPS cellen worden gebruikt voor compensatie: voorraden van 0,5-1 x 10 6 iPS cellen gehandhaafd op bestraalde MEF worden opgeslagen in cryovials in vloeibare stikstof. De aanwezigheid van MEFs is essentieel om een ​​signaal in de Thy-1.2 kanaal te komen. Ontdooi een cryovial van iPS cellen zoals beschreven voor MEF (hoofdstuk 3). Na centrifugatie wordt resuspendeer cellen in 800 gl labeling buffer en 200 ul van dit monster gereserveerd als ongelabelde controle. Gebruik de overblijvende cellen als compensatie controles. Verdeel cellen tussen drie buizen van 15 ml en voeg antilichamenals volgt: Pacific Blue compensatieregeling: voeg 0,5 pl van de anti-Thy-1.2 Pacific Blue antilichaam. FITC compensatie tube: voeg 0,5 pl van de anti-EpCAM antilichaam FITC. Pe-Cy7 compensatieregeling: 0.5 ul van de SSEA-1 anti-biotine antilichaam. Houd cel-antilichaam monsters op ijs gedurende 10 minuten, meng door te tikken en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Spoelmonsters met 10 ml koud PBS om ongebonden antilichaam te verwijderen, draaien cellen af ​​en zuig de supernatant. Resuspendeer celpellets in 200 ui FACS labeling media. Voor anti-SSEA-1-biotine gelabelde monsters, voeg een Streptavidine-PeCy7 conjugaat (1 gl per 200 gl cellen). Label cellen zoals beschreven voor primaire antilichaam (SSEA-1-biotine). Haal alle monsters waaronder de ongelabelde controle door een 70 urn zeef en voeg PI (2 ug / ml). Transfer cellen FACS buizen en blijf op ijs totdat vereist. 5 FACS Isolatie van Intermediates OPMERKING:Cellen worden gesorteerd met behulp van een Fluorescence Activated Cell Sorter met 405 nm, 488 nm en 560 nm excitatie lasers en 100 urn nozzle. Stel spanningen voor voorwaartse en zijwaartse verstrooiing waardoor de celpopulatie goed zichtbaar. Teken een hek rondom cellen zoals in figuur 5A om vuil sluiten. Opmerking: het bedoelde gebruik van spanningen op de cel sorter kan complex zijn en vereist een ervaren operator FACS. Gebruik voorwaartse verstrooiing (FSC) hoogte versus FSC gebied om aggregaten (figuur 5B) uit te sluiten. Visualiseer de PI-kanaal versus FSC tot poort in op de PI negatieve levende cellen (figuur 5C). Gebruik de ongelabelde cellen aan de spanningen voor de fluorescerende kanalen PB FITC / GFP, Pe-Cy7 passen. Idealiter plaats de celpopulatie aan het ondereinde van het desbetreffende kanaal. Stel poorten met het ongelabelde controle cellen, zoals weergegeven in figuur 6A, B om sub fractie de herprogrammering cultgelen in dag 3, 6 en 9 populaties: SSEA-1 / Thy-1.2 + cellen; SSEA-1 / Thy-1.2-cellen; en de herprogrammering tussenproducten SSEA-1 + / Thy-1.2-cellen. Verder op te splitsen van de Dag 9 SSEA-1 + / Thy-1.2-fractie met behulp van de Pe-Cy7 versus Fitc vlek; trekken hekken rond de SSE-a1 + / EpCAM + cellen en de SSEA-1 + / Epcam- cellen. Stel poorten met de ongelabelde controle cellen zoals getoond in figuur 6C, D. Prefill geschikte collectie buizen met iPS cel media (1-2 ml) voor het sorteren van de gewenste subpopulaties (zie Figuur 7 voor representatieve FACS profielen voor MEF, Dag 3 / Dag 6 / Dag 9 / Dag 12 culturen en iPS cellen). Voeren FACS sortering volgens produceert protocol. Na FACS isolatie indienen cellen moleculaire profilering (RNA / eiwit-extractie, chromatine immunoprecipitatie DNA methyloom analyse etc.). Alternatief kunnen de verschillende celfracties gekweekt.