גישה החדשנית Microdissection לשחזור<em> חפת Mycobacterium</em> תמלילים ספציפיים מפרפין קבוע פורמלין משובץ ריאות גרנולומות
Summary
Microdissection כבר מועסק באופן נרחב לבדיקה של DNA, RNA וחלבונים בתוך רקמה. לייזר מיקרוסקופית הלכידה (LCM) הוא השיטה הנפוצה ביותר, אך טכניקה חדשה כרסום, mesodissection, זמינה לאחרונה. אנו מדגימים מיצוי RNA מפרפין פורמלין mesodissected הקבוע שקופיות רקמות גלומות של גרנולומות חפת Mycobacterium.
Abstract
Microdissection כבר בשימוש לבדיקה של רקמות בDNA, RNA, ורמות חלבון במשך למעלה מעשור. לייזר מיקרוסקופית הלכידה (LCM) היא טכניקת microdissection הנפוצה ביותר בשימוש כיום. בטכניקה זו, לייזר משמש כדי להמס קרום תרמופלסטיים כי overlies קטע רקמה מיובש 1 focally. מרוכבים קטע רקמה אז הרים והפריד מן הקרום. למרות שטכניקה זו יכולה לשמש בהצלחה לבדיקת רקמות, זה זמן רב ויקר. יתר על כן, על סיומו המוצלח של נהלי שימוש בטכניקה זו דורש שימוש בליזר, ובכך להגביל את השימוש בו. גישת microdissection חדשה יותר זולה ומעשית הנקראת mesodissection היא פתרון אפשרי לחסרונות של LCM. טכניקה זו מעסיקה את מערכת MESO-1/MeSectr לטחנת הרקמה הרצויה מדגימת רקמת שקופיות רכובים בזמן במקביל מחלק וaspirating נוזל לשחזר את דגימת הרקמה הרצויה לתוךקצת טחנה מתכלה. לפני תהליך הנתיחה מתחיל, המשתמש מיישר פרפין הקבוע פורמלין המוטבע (FFPE) להחליק עם hematoxylin ו eosin מוכתם שקופיות התייחסות (H & E). לאחר מכן, מפעיל הוספת הערות לאזור הנתיחה הרצויה וממשיך לנתח את הקטע המתאים. התכנית יוצרת תמונת ארכיון של הנתיחה. היתרון העיקרי של mesodissection הוא משך הזמן הקצר הנדרש כדי לנתח שקופיות, לוקח ממוצע של עשר דקות מלהגדיר לדגום דור בניסוי זה. בנוסף, המערכת היא באופן משמעותי יותר חסכונית וידידותי למשתמש. חסרון קל הוא שזה לא מדויק כמו לייזר מיקרוסקופית הלכידה. במאמר זה אנו מדגימים כיצד mesodissection יכול לשמש כדי לחלץ RNA משקופיות מגרנולומות FFPE הנגרמת על ידי שחפת Mycobacterium (MTB).
Introduction
דגימות באופן מסורתי microdissected ידני משתי רקמות או שקופיות באמצעות מחט ואזמל כולה. הדבר מחייב הפרדה ברורה בין קטע הרקמה של עניין וחתכים רקמות הסובבים 2. עם ההתקדמות הנוכחית בטכנולוגיית אפיון מולקולרית, יש כבר צורך הולך וגובר להערכת רקמות ברמה התאית. בשל המגבלות של microdissection הידני, טכניקות כולל LCM הוקמו כדי לאפשר דיוק בידוד גדול יותר. טכניקה זו מאפשרת לחוקר לבודד אוכלוסיות תאים ספציפיות מסוגי תאים שונים ושקופיות, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו למבחנים במורד כגון פרופיל ביטוי גנים. למרות שמאוד יעיל למבחנים במורד הזרם, LCM אינו נטול מגבלות. ראשית, LCM הוא תהליך יקר וזמן רב. בנוסף, בשל האופי בלתי יציב של רנ"א, שהוא לעתים קרובות מאתגר להשיג RNA איכות גבוהה מדגימות LCM 2. בשל disadvantages של LCM, התפתחויות חדשות בתחום טכנולוגית microdissection עדיין דרושים כדי להפוך אותו לנגיש יותר למספר גדול יותר של חוקרים באופן רגיש במחיר סביר ובזמן.
כגון קידום אחד בטכנולוגית microdissection זמינה כעת הוא טכניקה המכונה mesodissection. בטכניקה זו מכונה משמשת לטחנת קטע הרקמה המבואר של העניין וaspirates אותו לקצת טחנה מתכלה 3. בשלב בא, מדגם זה יכול להישאף לתוך צינור איסוף ומשמש ליישומים במורד הזרם. יתרונותיה של מערכת זו הם שזה הרבה פחות יקר והזמן רגיש. מניסיוננו, המערכת מאפשרת לנתיחה של קטע רקמת גרנולומה ריאות בעשר דקות. מצד השני, LCM המסורתי עשוי לדרוש שעות כדי להשלים את התהליך. המערכת מאפשרת למפעיל כדי לטעון שקופיות התייחסות לשימוש כהשוואה, כמו גם כלי לביאור. בנוסף דו"ח מופק ה מתווהשטח E של השקופית שהיה גזור. ישנם שני חסרונות עיקריים לmesodissection. למרות יעיל בחילוץ תאים מרובים, זה מאתגר לבודד את תא בודד. בנוסף, הדיוק של התמונה שנוצרה הוא לא ברור כמו אם באמצעות מיקרוסקופים הדמיה אחרים.
שחפת (TB) היא רוצח גדול למחל זיהומיות של האנושות ברחבי העולם ותוצאות מזיהום עם MTB. ברוב של אנשים שנחשפו לאירוסולים של MTB, הזיהום מוגבל רדום. בלפחות 10 מיליון אנשים מדי שנה, התוצאה הוא מחלת שחפת פעילה 4. במהלך הזיהום לטנטי, MTB כלול בתוך נגעי ריאות פתולוגיים המכונים גרנולומות. מכאן זה כבר טען כי התוצאה של זיהום MTB יוחלט ברמה של גרנולומה 5.
כאן אנו מדגימים כיצד mesodissection יכול לשמש כדי microdissect גרנולומות נגרמת על ידי MTB. השקופיות המשמשותהם מרקמת הריאה FFPE מקופי רזוס נגוע. לצורך הפגנה זו, אנו לנתח גרנולומות בשלמותם. אנחנו גם מדגימים כי RNA יכול להיות מופק מהרקמות התאוששו. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על דגימות רקמה מדגימות שונות אחרות ולאחר מכן משמשת למגוון רחב של מבחני במורד הזרם.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissection היא טכניקה שניתן ליישם למיצוי RNA משקופיות נגע פתולוגיים נגרמות על ידי מגוון רחב של פתוגנים. זה הוא הכרח שהמשתמש עוקב אחר הדמות ומיישר את התמונה בצורה נכונה. כדי להשיג זאת, המכשיר חייב להיות מכויל בהתאם לכיווני תוכנת ההדמיה. כאשר לנתח, אם השקופית ואת תחומי עניי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר בפרסים / subawards הבא NIH לתמיכה של מחקר זה: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124 -08, וP51OD011104.
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Fend., F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53(9):666-72. (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection–increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593:54-65. doi: 10.1007/978-0-387-39978-2_6. (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14(6):745-. (2012).
- Fleischmann, R.D., Alland, D., Eisen, J.A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184(19):5479-90. (2002).
- Russell, D.G., Barry 3rd, C.E., Flynn, J.L. Tuberculosis: what we don’t know can, and does, hurt us. Science. 328(5980):852-6. doi: 10.1126/science.1184784. (2010).
- AvanSciBio. Mesodissection of fibrous tissue. <http://avansci-bio.com/uploads/CDP-15_Mesodissection_of_Fibrous_Tissue_Rev_B.pdf> (2013).
- Paige, C., Bishai, W.R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe’s point of view. Cell Microbiol. 12(3):301-9. Epub 2009/12/31. doi: 10.1111/j.1462-5822.2009.01424.x. PubMed PMID: 20039878 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P.J., Doyle, L.A., Blanchard, J.L., Lackner, A.A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207(7):1115-27. doi: 10.1093/infdis/jis778. (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B.G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. 99(12):8330-5. doi: 10.1073/pnas.102055799. (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191(12):3965-80. doi: 10.1128/JB.00064-09. (2009).
- Rohde, K.H., Veiga, D.F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D.G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8(6):e1002769. doi: 10.1371/journal.ppat.1002769. (2012).
- Fontan, P.A., Voskuil, M.I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191(18):5628-33. doi: 10.1128/JB.00510-09. (2009).
- Rustad, T.R., Harrell, M.I., Liao, R., Sherman, D.R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3(1):e1502. doi: 10.1371/journal.pone.0001502. (2008).
