Статический Адгезия Анализ по изучению активации интегрина в Т-лимфоцитов

Т адгезии лимфоцитов является фундаментальным процессом в иммунном ответе ^1. Он необходим для T взаимодействия клеток с эндотелиальные клетки украшать стенки капилляров, для сканирования антиген представляющих клеток (АРС) в лимфатические узлы, и для формирования иммунологических синапсов (IS) с клетками-мишенями ^2. Эти требования являются функционально и кинетически различны. Процесс лимфоцитов экстравазационным состоит из хемоаттракции, прокат, фирмы адгезии и переселения. Переход от подвижного фирме адгезии требуется Т-клеток реагировать на G-белком сигнала рецепторов быстро. Этот ответ дает интегрину взаимодействие лиганда, который замедляет и аресты качению ячейку ^3. Немедленное изменение интегринового жадностью посредником этот процесс. Миграция требует динамического взаимодействия betweenTcells и эндотелиальные клетки с образованием спаек в «переднем конце» и поломки спаек в "задней части"с интервалом около минуты между формирования и разрушения ^4. ЕСТЬ формирует inminutes, но должен оставаться нетронутым в течение нескольких часов ^6.

Интересно, что одна молекула адгезии, интегрин семья функция-член лимфоцитов антиген (МАФ) – 1, имеет важное значение для всех этих процессов ^5. LFA-1 опосредует адгезию через взаимодействие с несколькими членами надсемейства иммуноглобулинов. Наиболее широко изучены лиганд с наибольшим сродством к LFA-1 межклеточной адгезии (ICAM) -1. Неактивированного циркулирующие лимфоциты экспрессируют низкое сродство LFA-1 на поверхности клеток и, следовательно, не могут придерживаться ICAM-1 покрытием поверхности. LFA-1 сродство является переменной и регулируется несколькими сигнальных событий, таких как G активации белком рецептор цитокина, стимуляции и сигналов, опосредуемых Т-клеточных рецепторов (TCR). Полученную высокое сродство форма LFA-1 передает внутриклеточный активации во внеклеточное пространство твозь взаимодействия с ICAM-1. Этот путь называется наизнанку сигнализации ^7. Кроме того, передачи сигналов через LFA-1 из внеклеточного пространства называется снаружи внутрь сигнализации.

Внутриклеточный каскады, участвующих в наизнанку и за ее пределами в сигнализации сигнализации являются одним из основных направлений современных исследований. Небольшой ГТФ Rap1 недавно стала ключевой составляющей наизнанку понять, что является общим как для TCR перевязки и цитокина сигнализации ^8. Решающая роль Rap1 в активации интегринового выделен в связи с открытием, что избыточная экспрессия Rap1 стимулирует интегринзависимой адгезию Т-клеток, в то время как Т клеточной адгезии заблокирован выражения доминантной негативной Rap1 ^9. Эти достижения в нашем понимании интегринового регулирования Rap1 были совершены с использованием в инструментах пробирке. Среди них статический адгезия анализа, описанного здесь.

Общая цель этого метода состоит в изучении Tклеток адгезия к ICAM-1 поверхностей, покрытых. Более конкретно, оно используется для объективно оценивать количественно и LFA-1 сродство к его счетчик лигандов в живых клетках в реальном времени, при разных условиях. Этот метод использует полистирола лунки, покрытые ICAM-1, чтобы имитировать клеточные поверхности, что Т-клетки взаимодействуют с. Многие описанные ранее адгезии статическая Т-клеток анализы были экспериментально комплекс. Эти анализы часто требуется для Т-клеток, которые будут радиоактивно метили, используемые культивируемые клетки роговицы крупного рогатого скота, чтобы создать внеклеточный матрикс в качестве субстрата для T клеточной адгезии, или называют для не-физиологической стимуляции Т-клеток в течение длительного срока, чтобы способствовать T клеточную адгезию ^10. Использование флуорометрического измерения для количественной оценки Т-клеток после инкубации адгезии является более чувствительным и точным методом количественного по сравнению с проточной цитометрии и микроскопии, как используются во многих других системах анализа ^11. Кроме того, один Микроскоп клетокИК анализ локализации интегрина не допускает широкий, населения на основе анализа так же, как флуорометрического измерения. Хотя активации специфичные для состояния LFA-1 антитела являются коммерчески доступными, эти антитела предложить низкую чувствительность по отношению к способу, описанному здесь. Основное преимущество над альтернативными методами является его простота и способность исследовать различные экспериментальные условия одновременно. При рассмотрении этого метода для конкретного приложения, следует принять во внимание, что Т-клетки должны быть негативно выбран, свежевыделенные, и помечены с флуоресцентным маркером.