Alto Rendimiento Purificación de<em> Plasmodium falciparum</em> Los merozoitos Para uso en opsonizante Antibody Ensayos

NOTA: Todos los pasos, además de centrifugación y citometría de flujo, se deben realizar dentro de una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad. Asegúrese de que se tomen las debidas precauciones en cuanto a la manipulación de las muestras humanas. El ensayo es muy sensible para pequeñas cantidades de plasma. Las diluciones previstas son óptimas para la resolución de respuestas que van desde 5 hasta 78% con el plasma de los niños semi-inmunes de Papúa Nueva Guinea (PNG). La dilución óptima puede variar con los aparatos de plasma están probando, y por lo tanto se recomienda que el plasma se titula para determinar las condiciones experimentales para cada aplicación. Asegurar la inclusión de 2 controles negativos células THP-1 con merozoitos en ausencia de plasma; y THP-1 células con merozoitos opsonizadas con un pool de plasma procedente de individuos no tratados previamente de malaria. Esto permitirá que el control para la adherencia de merozoitos a las células THP-1 y para permitir rigurosa gating citometría de flujo de eventos de fagocitosis. El uso de muestras de plasma fue PNGaprobado por el Comité Consultivo de Investigaciones Médicas, Papua Nueva Guinea Ministerio de Salud, el Walter y Eliza Pasillo Comité de Ética en Investigación del Instituto Humano (número de proyecto 04/04). Se obtuvo consentimiento escrito de los padres / tutores de todos los participantes. 1. THP-1 Cultura Mantener la línea celular monocítica humana THP-1 en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 55 mM 2-mercaptoetanol (THP-1 medio) y a 37 ° C en una incubadora de CO 2 humidificado 5%. Mantener las células a una densidad por debajo de 5 x 10 5 células / ml. NOTA: El crecimiento excesivo dará lugar a la diferenciación en células adherentes y baja regulación de los receptores Fc. Una vez que las células han sido pases aproximadamente 10 veces, descongelar un nuevo vial para mantener el fenotipo celular. 2. Preparación de muestras y dilución de anticuerpos Plasma inactive por calor a ensayar y el plasma de control de la malaria ingenuo mediante la incubación a 56 °; C durante 30 min En serie diluir las muestras de plasma a 1/2, 000 en THP-1 medio. Plasma tienda diluida a -20 ° C. 3. Cultura de altamente sincronizada P. falciparum NOTA: La línea de parásitos que expresan GFP-D10 PfPHG 27 fue utilizado debido a su ciclo de vida de 48 horas que ayuda a la sincronización de los parásitos y la sincronización controlada de adición E64. Además, dado que esta línea expresa GFP en el citosol, esta línea permite la detección de parasitemia y merozoitos libres por la detección de citometría de flujo de la GFP. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia de GFP no es suficiente para proporcionar una visualización dentro de las células THP-1, y por lo tanto, los merozoitos se contratiñeron con bromuro de etidio (EtBr). Otras cepas de parásitos pueden ser utilizadas, a condición de que la sincronía apretado es alcanzable. Sincronizar parásitos usando una combinación de tratamiento de sorbitol para lisar formas maduras 28 y heparina para inhibir la invasión 15 </sarriba>. Mantener P. falciparum parásitos en O + eritrocitos humanos (RBC) en 3% de hematocrito en medio RPMI-1640 (pH 7,4) suplementado con 25 mg / ml de Hepes, 50 g / hipoxantina ml, 10% de suero humano combinado, 2 mg / bicarbonato de sodio ml, y 20 mg ml de gentamicina (medio Parásito) /. Añadir 5 mg / ml de blasticidina S-hidrocloruro para el medio de cultivo para seleccionar para GFP + parásitos. Incubar culturas en cajas herméticas o frascos de cultivo, alternativamente doble sellado a 37 ° C en una atmósfera de 1% de O 2, 4% de CO2 y 95% de N2. Preparar frotis delgados diapositivas, fijar en 100% de metanol durante 10 seg, y la tinción con solución de Giemsa al 10% en 6,7 mM (pH 7,1) tampón de fosfato (solución de Giemsa) durante 10 min para controlar la parasitemia. Después de la tinción, lavar el portaobjetos en agua y aire seco. Evaluar parasitemia usando un lente de inmersión en aceite de 100X. Mantener las culturas del parásito a una parasitemia por debajo del 5% RBC infectado mediante el fraccionamiento de las culturas y la adición no infectadaRBC como se requiere. Para sincronizar con la heparina, añadir 20 UI / ml de heparina de grado médico de anillo etapas culturas. Cuando la mayoría de los parásitos se encuentran en la etapa de esquizonte sedimenta células a 300 xg durante 5 minutos, retire el medio que contiene heparina y resuspender en medio parásito para permitir la ruptura de esquizontes y merozoite invasión. Después de 4 horas, se añaden 20 UI / ml de heparina de nuevo a las culturas, el bloqueo de cualquier invasión merozoite más. NOTA: Varios ciclos de sorbitol y el tratamiento con heparina pueden ser necesarios antes de parásitos están suficientemente sincronizados. Para generar un número adecuado de merozoitos, preparar 150 ml de cultivo de parásitos a las 3 – 5% de parasitemia. 4. Aislamiento de finales de la etapa P. falciparum trofozoítos Treinta y seis horas después de volver a la heparina culturas, sedimentar las células cultivadas a 300 xg durante 5 min, y Resuspender el sedimento en medio del parásito al 25% de hematocrito. Adjunte una gran columna magnética (volumen de la matriz de 6,3ml) a un imán, y equilibrar la columna con medio de parásito, asegurándose de que se eliminan todas las burbujas de aire. Añadir el P. resuspendido cultura falciparum a la columna, y ajustar la tasa de flujo a una gota por segundo. Una vez que la cultura ha pasado a través de la columna, lavar la columna con medio parásito hasta que el flujo a través salga clara. Eluir parásitos de la columna en 30 ml de medio de parásito 37 ° C. Preparar un frotis delgado de parásitos, fijar en metanol al 100% durante 10 segundos, y manchar con solución Giemsa durante 3 min. Examine el portaobjetos bajo el microscopio, y garantizar que los parásitos casi llenan los glóbulos rojos, y parecen estar en las etapas tempranas de esquizontes. Si los parásitos no han llegado a la etapa de maduración adecuado, regrese parásitos purificados a una incubadora a 37 ° C en una atmósfera de 1% de O 2, 4% de CO2 y 95% de N2 hasta desarrollado adecuadamente. Se requiere pureza mayor que 90% de las células rojas de la sangre infectadas para asegurar R: NOTAChalecos No contaminar las preparaciones de merozoitos. Tratar esquizontes aislados con 10 mM E64 (epoxisuccinil-L-leucilamido (4-guanidino) butano (E64) de 6 – 10 horas NOTA:. Tiempos de incubación más largos con E64 son posibles, sin embargo los merozoitos producidos ya no ser invasiva. 5. Aislamiento de P. falciparum merozoitos Tras la incubación con E64, frotis parásitos, fijar las células en el 100% de metanol, y se tiñen con Giemsa solución para evaluar la formación de merozoitos rodeados de membrana. NOTA: Se obtendrá un buen rendimiento de merozoitos si más del 50% de los parásitos han formado membrana merozoitos cerrados. Esquizontes Pellet E64 tratada a 1900 × g durante 8 min. Lavar con 50 ml de medio RPMI-1640 RT (pH 7,4) suplementado con 25 mg / ml de Hepes, 50 mg / ml de hipoxantina, 2 mg / ml de bicarbonato de sodio, y 20 mg / ml de gentamicina (medio de lavado) para retirar los restos de suero humano . Resuspender el sedimento en 2 ml de medio de lavado. NOTA: El uso de FCS que contienen THP-1 producirá la formación de espuma durante la filtración. Filtrar los 2 ml de resuspendidos E64-esquizontes a través de un filtro de jeringa de 1,2 mm μm/32. Recoger el filtrado en un tubo de 10 ml. NOTA: El filtrado contiene merozoitos y cristales hemozoína, con esquizontes un-roto y escombros recogidos en el filtro. Coloque una pequeña columna magnética a un imán, y equilibrar con 500 l THP-1 medio. Pase el filtrado sobre la columna magnética. Recoger el flujo a través. NOTA: hemozoína se unirá a la columna, mientras que pasarán a través de merozoitos. Pasar el flujo a través sobre la columna dos veces más para eliminar hemozoína, recoger el flujo a través de cada vez. Lavar la columna con 2 ml de RT de THP-1 medio para recoger cualquier merozoitos restantes. Añadir EtBr a 10 g / ml (concentración final) y la mancha durante 30 min a TA. Proteger de la luz para evitar photobleaching. Nota: Asegúrese de que todo el líquido y p EtBr contaminadaresiduos Lastic está dispuesto de una manera adecuada para los productos químicos citotóxicos. Los merozoitos ya no son invasivos Después de esta incubación. Decantar merozoitos a 4.000 xg durante 10 min. Desechar el sobrenadante en un recipiente apropiado para desechos. Resuspender pellet merozoito en 4 ml de THP-1 medio, y girar hacia abajo a 4000 xg durante 10 min. Añadir THP-1 medio hasta un volumen de 15 ml, y protegerlo de la luz. 6. Cuantificación Merozoite Concentración por Citometría de Flujo Lleve cuenta granos a RT. Preparar PBS con 0,5% de BSA para diluir merozoitos. Cuente merozoitos en 3 diluciones; 1 en 100; 1 en 50 y 1 en 25. Preparar tubos 3 FACS con 940, 930 y 910 l de PBS 0,5% BSA, respectivamente. Añadir 10, 20 y 40 l de merozoitos purificados por tubo, respectivamente. Contar bolas Vortex durante 30 segundos, y añadir 50 l de perlas al tubo de FACS que contenía merozoitos diluidas. Ejecute los tres dilmuestras de merozoitos buido en un citómetro de flujo equipado con un láser de 488 nm. Establecer una puerta estricto para merozoitos basados ​​en EtBr y la fluorescencia de GFP fluorescencia dual, y contar bolas puerta por la fluorescencia en un canal separado. Adquirir eventos hasta que se recogieron 2.000 granos. Nota: Estas instrucciones se refieren a contar las buenas prácticas agrarias + merozoitos que han sido teñidos con mostrador con EtBr. Si no la utilización de parásitos que expresan GFP entonces establecidos puertas de merozoitos basado en la dispersión lateral y la fluorescencia de EtBr. Determine la relación de merozoitos: Granos dividiendo el número de eventos de merozoitos por los 2.000 eventos de conteo de cuentas, calcular un coeficiente para cada dilución. Utilice las especificaciones de lote de cuentas de conteo para determinar el número de cuentas en los 50 l de cuentas añadidas por tubo. Multiplicar el número de cuentas en 50 l por el factor de dilución y por el merozoito: relación de grano para que el factor de dilución. Este número es igual a la concentración de merozoitos por ml. RealizarlESE pasos para cada dilución. La media de los merozoitos concentraciones medidos en las tres diluciones. NOTA: Las desviaciones estándar por encima de 10% para las concentraciones determinadas para 1 en 100, 1 en 50 y 1 en 25 diluciones indican imprecisiones técnicas en la preparación de muestras de recuento. Resuspender merozoitos en 8 x 10 6 merozoitos / ml en medio de THP-1 para garantizar una relación final de cuatro merozoitos por THP-1 células. NOTA: Otros merozoite a THP-1 coeficientes puede ser utilizada, y las concentraciones deben modificarse en consecuencia. 7. Ensayo de fagocitosis Añadir 200 l de calor FCS inactivos por pocillo de 96 pocillos de fondo en U, y dejar a temperatura ambiente O / N para bloquear las placas. Después de la incubación, retire FCS y lavar los pocillos dos veces con 200 l de PBS estéril. Retirar PBS y las placas se almacenan a 4 ° C hasta que sea necesario. Calcular el número de células THP-1 requeridos para poner a prueba las muestras de plasma y los controles, lo que permite pocillos triplicados por muestra a 1 x 10 <sup> 5 células THP-1 por pocillo. Determinar THP-1 concentración cultura mediante la carga de 10 l de la cultura sobre un porta hemocitómetro. Contar el número de células presentes en 4 series de 16 cuadrados de las esquinas del hemocitómetro bajo un microscopio, a continuación, el promedio de los conteos. Multiplicar el recuento promedio por 10000 para calcular el número de células por ml. Decantar el número necesario de células THP-1 a 500 xg durante 5 min, y volver a suspender en 6,7 x 10 5 células / ml en THP-1 medio. Añadir 150 l de células THP-1 en células THP-1 medio por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo en U bloqueado-FCS, dando como resultado 10 5 células / pocillo. Preparar 3 pocillos por muestra, que se probarán. Placa de retorno a la incubadora hasta que esté listo para agregar merozoitos. Añadir 150 l de preparación de merozoitos en 8 x 10 6 / ml por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U separada bloqueado-FCS. Preparar un pocillo por muestra analizada Añadir 10 l de las muestras de plasma diluidas preparadas por pozo, en tél plato que contiene los merozoitos, y mezclar bien para asegurar una solución homogénea. Retire la placa de THP-1 de la incubadora, y añadir 50 l de la solución de merozoitos / plasma por pocillo que contiene células THP-1, con tres pozos por muestra de plasma. Mezclar bien e incubar a 37 ° C en 5% de CO 2, incubador humidificado durante 40 min. Cubrir con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Después de 40 min, las muestras de centrifugación durante 5 min a 500 xg en un 4 ° C preenfriar centrífuga para detener la fagocitosis. Eliminar el sobrenadante y lavar las células dos veces en PBS enfriado con hielo 0,5% de BSA mM EDTA 2 (tampón FACS). NOTA: EDTA facilitará en el mantenimiento de una suspensión de células para análisis de citometría de flujo. Fijar las células en 90 l de 2% de paraformaldehído (PFA) en PBS 0,5% BSA mM EDTA 2 (FACS fijador). Deja en hielo hasta la adquisición, protegido de la luz. 8. Citometría de Flujo Adquirir muestras usando un citómetro de flujo equipado with un láser de 488 nm y un alto rendimiento lector de placa de fijación. NOTA: Esto permitirá que hasta 400 muestras de plasma para ser probado de una preparación de merozoitos. Las células también pueden ser transferidos a tubos para la carga manual de las muestras. Gate viables THP-1 células de dispersión frontal y lateral. Ajuste la puerta segura de EtBr en base a las "células THP-1 con merozoitos y no hay plasma 'control. Adquiera un mínimo de 10.000 eventos por muestra. 9. Análisis de Datos Analizar datos usando citometría de flujo de software de análisis, y establecer puertas estrictas para eventos EtBr positivos. Calcular el porcentaje de fagocitosis para cada muestra: el% de + células EtBr para la muestra, menos las células positivas% con plasma no inmune. Los resultados promedio de todo por triplicado. NOTA: Las desviaciones estándar para un triplicado en exceso de 10% indican imprecisiones experimentales. Algunos eventos fondo EtBr positivos se pueden observar como resultado de merozoiTE adhesión a la superficie de las células THP-1, pero debe ser consistente a través de todas las muestras que contienen merozoitos. Ajuste de la puerta sobre la base de las "células THP-1 con merozoitos y no plasma" control, y luego restar cualquier fondo de las "células THP-1 con plasma no inmune" control dará lugar a la fagocitosis% que refleja la fluorescencia debido a internalizado / fagocitado sólo merozoitos.