높은 수익률 정화<em> 변형체 falciparum의</emOpsonizing 항체 분석 실험에 사용하기 위해> Merozoites

NOTE : 모든 단계, 원심 분리 및 유동 세포 계측법 게다가, 무균 유지를 층류 후드 내에서 수행되어야한다. 적절한 예방 조치가 인간의 시료의 취급에 관한 촬영되어 있는지 확인합니다. 분석은 플라즈마의 적은 양에 매우 민감하다. 78 % 파푸아 뉴기니 (PNG)에서 반 면역 아이들 플라즈마 – 제공하는 희석 5 이르기까지 응답을 해결하기위한 최적입니다. 최적의 희석은 플라즈마 세트는 테스트중인에 따라 달라질 수 있으며, 따라서 플라즈마는 각 응용 프로그램에 대한 실험 조건을 결정하는 적정하는 것이 좋습니다. 플라즈마의 부재에 merozoites 2 음성 대조군 THP-1 세포의 포함을 확인합니다; 및 merozoites와 THP-1 세포가 말라리아 순진 개인의 플라즈마의 풀과 옵 소닌. 이 THP-1 세포에 merozoite 준수에 대한 제어를 허용하고 식균 작용 이벤트의 엄격한 유동 세포 계측법 게이팅을 활성화 할 수 있습니다. PNG 혈장 샘플을 사용했다의학 연구 자문위원회, 보건 파푸아 뉴기니 장관, 월터와 엘리자 홀 연구소의 인간 연구 윤리위원회 (프로젝트 번호 4월 4일)에 의해 승인. 서면 동의가 모든 참가자의 부모 / 보호자로부터 얻은 것입니다. 1. THP-1 문화 5 % CO 2 배양기에서 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 55 μM 2 mercapthoethanol (THP-1 매체)로 보충 RPMI-1640 배지에서 37 ° C에서 인간 단핵구 세포주 THP-1을 유지한다. 5 × 10 5 세포 / ml 이하의 농도에서 세포를 유지한다. 참고 : 전면에 자라 난이 부착 세포로 및 아래로 규제 구단 수용체의 분화가 발생합니다. 세포가 약 10 회 계대 배양 한 후, 세포의 표현형을 유지하기 위해 새로운 바이알을 해동. 2. 항체 샘플 준비 및 희석 열을 비활성화 플라즈마는 56 ℃에서 배양하여 테스트 말라리아 순진 제어 플라즈마 할; 30 분 C 직렬 THP-1 매체에 1 / 2, 000로 혈장을 희석. -20 ° C.에 보관 희석 플라즈마 고 동기화 P. 3. 문화 열대열 참고 : GFP – 표현 기생충 라인 D10-PfPHG 27 인해 기생충의 동기화 및 E64 첨가의 제어 타이밍을 지원의 48 시간의 라이프 사이클에 활용되었다. 이 라인은 세포질에서 GFP를 표현하기 때문에 또한,이 라인은 GFP의 유세포 감지하여 parasitaemia 무료 merozoites 감지 할 수 있습니다. 그러나, GFP의 형광 강도는 THP-1 세포 내에서 시각화를 제공하기에 충분하지 않고, 따라서 merozoites 티듐 브로마이드 (EtBr)와 대조된다. 다른 기생충 변종 꽉 싱크로 달성 것을 제공, 이용 될 수있다. 내습 15을 억제하는 성숙한 형태 28과 헤파린을 용해하는 소르비톨 처리를 조합하여 기생충 동기화 </s업>. P.에게 유지 원충은 RPMI-1640 배지에 3 % 용적률 25 ㎎ / ㎖ HEPES, 50 ㎍ / ㎖의 산틴, 10 % 풀링 된 인간 혈청, 2 ㎎ / ㎖ 탄산 수소 나트륨과 보충 (산도 7.4)에서 O + 인간의 적혈구 (RBC)에서 기생충 및 20 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신 (기생충의 중간). GFP + 기생충 선택 배지에 5 ㎎ / ㎖ 블라 S-염산을 추가합니다. 1 % O 2, 4 % CO 2와 95 % N 2 분위기에서 37 ° C의 공기 단단한 상자 또는 선택적으로 이중 밀봉 배양 플라스크에 문화를 품다. 얇은 얼룩 슬라이드를 준비하는 10 초 동안 100 %의 메탄올에 수정 한 6.7 밀리미터 (산도 7.1) 기생충을 모니터링하는 10 분 동안 인산염 완충액 (지엠 사 (Giemsa) 용액)의 10 % 지엠 사 (Giemsa) 용액으로 얼룩. 염색 후, 물, 공기 건조에 슬라이드를 씻어. 100X 기름 침지 렌즈를 사용하여 기생충을 평가합니다. 문화를 분할하고 감염되지 않은 추가 5 % 감염된 RBC 아래 기생충에 기생 문화를 유지RBC 필요. 헤파린과 동기화, 문화 단계 링 의료용 헤파린의 20 IU / ㎖를 추가합니다. 기생충의 대부분이 schizont 단계에있을 때, 5 분 300 XG에 펠렛 세포는 schizont 파열 및 merozoite의 침입을 허용하는 기생충의 중간에있는 헤파린 함유 중간에 resuspend를 제거합니다. 4 시간 후, 더 merozoite의 침입을 차단, 다시 문화 20 IU / ml의 헤파린을 추가합니다. 참고 : 기생충이 충분히 동기화되기 전에 소르비톨 및 헤파린 치료의 여러 사이클이 요구 될 수있다. 5 % parasitaemia – merozoites의 적절한 숫자를 생성하기 위해, 3에서 기생충 문화 150 ㎖를 준비합니다. 늦은 단계 P. 4. 분리 열대열 Trophozoites 서른 여섯 시간의 문화에 헤파린을 반환 한 후, 5 분 300 XG에서 배양 된 세포를 펠렛, 25 %의 적혈구에 기생 매체에 resuspend 펠렛. 큰 자기 칼럼 (6.3 매트릭스 볼륨을 연결합니다ML) 자석에, 모든 기포가 제거되었는지 확인하고, 기생충 매체와 열 평형. 재현 탁 P. 추가 falciparum의 문화 칼럼 및 초 당 한 방울로 유량을 조정합니다. 문화 컬럼을 통과하면 흐름을 통해 분명히 실행될 때까지, 기생충 매체로 열을 씻는다. 37 ° C 기생충 배지 30 ㎖의 열에서 기생충을 용출. 기생충의 얇은 얼룩을 준비 10 초 동안 100 %의 메탄올에 고정하고, 3 분 동안 지엠 사 (Giemsa) 용액으로 염색. 현미경 슬라이드를 검사, 기생충이 거의 적혈구를 작성하고 초기 schizont 단계에있는 것으로 표시되는지 확인합니다. 기생충은 적절한 성숙 단계에 도달하지 않은 경우 적절하게 개발 될 때까지, 1 % O 2, 4 % CO 2와 95 % N 2 분위기에서 37 ° C 배양기에 정제 된 기생충을 반환합니다. NOTE : 90 % 이상 감염된 적혈구의 순도는 R을 보장하기 위해 필요수익 증권은 merozoite 준비를 오염시키지 마십시오. . 10 μM E64 6 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4 – 구 아니 디노) 부탄 (E64)와 격리 된 schizonts 치료 – 10 시간 주 : E64와 긴 배양 시간이 가능하다, 그러나 생산 merozoites는 더 이상 침략 수 없습니다. P. 5. 격리 열대열 Merozoites E64와 함께 배양 한 후, 100 % 메탄올에 세포를 고정하고, 막 동봉 merozoites의 형성을 평가하는 지엠 사 (Giemsa) 솔루션 얼룩, 기생충을 바른다. 주 : 기생충의 50 % 이상이 막 동봉 merozoites을 형성 한 경우 merozoites의 좋은 수익률을 얻을 수 있습니다. 펠렛 8 분 1,900 XG에서 schizonts를 E64 처리. 나머지 인간 혈청을 제거하기 위해 RT RPMI-1640 배지 50 ㎖의 25 ㎎ / ㎖ HEPES, 50 ㎍ / ㎖의 산틴, 2 ㎎ / ㎖ 탄산 수​​소 나트륨, 20 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신 (세척 중) 보충 (산도 7.4)로 세척 . 세척 배지 2 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 참고 : THP-1 미디어를 FCS가 함유하여 여과하는 동안 거품을 생성합니다. 1.2 μm/32 mm의 주사기 필터를 통해 재 부유 E64-schizonts의 2 ㎖를 필터링합니다. 10 ML 튜브에 여과 액을 수집합니다. 참고 : 여과 필터에서 수집되지 않은 파열 schizonts 및 파편, merozoites 및 hemozoin 결정이 포함되어 있습니다. 자석에 작은 자석 열을 부착하고, 500 ㎕의 THP-1 매체 평형. 자기 칼럼을 통해 여과 액을 전달합니다. 흐름을 통해 수집합니다. 참고 : merozoites 통과 반면 Hemozoin는 열에 바인딩합니다. 각각의 시간을 통해 흐름을 수집, hemozoin을 제거하려면 열 두 번에 걸쳐 흐름을 통해 전달합니다. 나머지 merozoites를 수집하는 RT THP-1 배지 2 ㎖로 컬럼을 씻어. 10 ㎍ / ㎖ (최종 농도) 및 RT에서 30 분 동안 얼룩에 EtBr을 추가합니다. 광표백을 방지하기 위해 빛으로부터 보호합니다. 주 : 확인 모든 EtBr 오염 된 액체 및 Plastic 폐기물은 독성 화학 물질에 적합한 방식으로 배치된다. Merozoites이 배양 한 다음 더 이상 침략 없습니다. 10 분 동안 4,000 XG에서 merozoites 스핀 다운. 적절한 폐기 용기에 상층 액을 버린다. 4 ML THP-1 매체에 merozoite 펠렛을 재현 탁하고, 10 분 동안 4,000 XG에 스핀 다운. 15 ML의 볼륨 THP-1 매체를 추가하고 빛으로부터 보호합니다. 유동 세포 계측법 6. 수치화 Merozoite 집중 RT에 구슬을 계산 가져와. merozoites을 희석 0.5 % BSA와 PBS를 준비합니다. 3 희석에 merozoites 카운트; (100)에서 1; 50 1 25 1. 각각 PBS +0.5 %의 BSA의 940, 930 및 910 μL로 3 FACS 튜브를 준비합니다. 각각 튜브 당 정제 merozoites의 10, 20, 40 μl를 추가합니다. 30 초 동안 소용돌이 계산 구슬, 및 희석 merozoites을 포함하는 FACS 튜브 당 구슬의 50 μl를 추가합니다. 세 DIL을 실행흐름 uted의 merozoite 샘플 사이토 488 nm의 레이저를 탑재. 별도의 채널에서 형광에 의해 EtBr 및 GFP의 형광 이중 형광에 기초 merozoites, 게이트 카운트 구슬의 엄격한 게이트를 설정합니다. 2,000 비즈가 수집 될 때까지 이벤트를 취득. 참고 :이 지침은 EtBr로 반대 염색 한 GFP + merozoites 계산을 참조하십시오. 다음 측 분산 및 EtBr 형광에 기초 merozoite 게이트를 설정 기생충을 표현 GFP를 사용하지 않는 경우. merozoites의 비율 결정 : 2000 카운트 비드 이벤트에 의해 merozoite 이벤트의 수를 분할함으로써 비드를 각각 희석 비율을 계산한다. 튜브 당 추가 구슬의 50 μL에 구슬의 수를 결정하는 계수 구슬 배치 사양을 사용합니다. 희석 요인에 의해 merozoite 50 μL에 구슬의 수를 곱 : 그 희석 계수에 대한 비드 비율을. 이 숫자는 ML 당 merozoites의 농도가 동일합니다. 일을 수행각 희석 단계를 이거지. 세 희석에 걸쳐 측정 merozoite 농도를 평균. 50에서 100, 1에서 1 결정 농도가 10 %를 초과하는 표준 편차를, 1 (25)의 희석 계수 샘플을 준비 기술적으로 부정확 한 내용을 나타냅니다합니다. THP-1 세포 당 네 개의 merozoites의 최종 비율을 보장하기 위해 THP-1 배지에서 8 × 10 6 merozoites / ㎖에서 merozoites을 재현 탁. THP-1 비율로 다른 merozoite이 사용될 수 있고, 농도를 적절하게 수정해야합니다. 7. 식균 작용의 분석 96 웰 U-바닥 플레이트 잘 당 열 비활성 FCS 200 μl를 추가하고, 번호판을 차단하는 RT O / N에 둡니다. 배양 한 다음, FCS를 제거하고 200 ㎕의 멸균 PBS로 두 번 우물을 씻어. 필요한 때까지 4 ° C에서 PBS 및 저장 플레이트를 제거합니다. 1 ×에서 샘플 당 삼중 웰을 허용 혈장 샘플 및 컨트롤을 테스트하는 데 필요한 THP-1 세포의 수를 계산 <suP> 5 THP-1 세포 물론 당. 혈구의 슬라이드에 문화의 10 μl를로드하여 THP-1 문화 농도를 결정합니다. 현미경 하에서 혈구의 16 각형의 사각형의 4 세트에 존재하는 세포의 수를 계산 한 후 카운트를 평균. 밀리리터 당 세포의 수를 계산하기 만함으로써 평균 횟수를 곱한다. 5 분 동안 500 XG에서 THP-1 세포의 필요한 개수를 스핀 다운하고, THP-1 배지에서 6.7 × 105 세포 / ml로 재현 탁. 10 5 세포 / 웰의 결과로, FCS 차단 된 96 개의 U-바닥 판에 잘 당 THP-1 매체 THP-1 세포의 150 μl를 추가합니다. 테스트 할 샘플 당 3 우물을 준비합니다. merozoites를 추가 할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. 물론 별도의 FCS 차단 96 개의 U-바닥 판에 8 × 10 6 / ml의 당에 merozoite 준비의 150 μl를 추가합니다. 테스트 샘플 당 하나의 잘 준비 t에 잘 당 준비 희석 혈장의 10 μl를 추가합니다그는 그 merozoites을 포함 접시, 그리고 균일 한 솔루션을 보장하기 위해 잘 섞는다. 인큐베이터에서 THP-1 플레이트를 제거하고, 혈장 샘플 당 세중 우물에 잘 THP-1 세포를 포함하는 당 merozoite / 플라즈마 솔루션의 50 μl를 추가합니다. 잘 혼합하고, 5 % CO 2, 40 분 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 알을 품다. 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 커버. 40 분, 4 ° C에서 500 XG에서 5 분 원심 분리기 샘플은 식균 작용을 체포하기 위해 원심 분리기를 prechilled 후. 상층 액을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS +0.5 %의 BSA +2 mM의 EDTA (FACS 버퍼)에 두 번 세포를 씻으십시오. NOTE : EDTA는 유세포 분석을위한 단일 세포 현탁액을 유지하는 것을 용이하게 할 것이다. PBS +0.5 %의 BSA +2 mM의 EDTA (FACS 정착액)에서 2 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 90 μl의 세포를 수정. 빛으로부터 보호를 인수 할 때까지 얼음에 둡니다. 8. 유동 세포 계측법 탑재 WI 플로우 사이토 미터를 사용하여 샘​​플을 획득488 nm의 레이저 및 높은 처리량 플레이트 리더 첨부 파일을 토륨. 참고 :이 하나 merozoite 준비에서 테스트 할 400 혈장까지 가능하게 할 것이다. 세포는 또한 수동 시료 로딩 튜브로 옮겨 질 수있다. 전방 및 측면 산란에 의한 게이트 가능한 THP-1 세포. 컨트롤 'mero​​zoites없이 플라즈마 THP-1 세포'에 따라 EtBr 긍정적 인 게이트를 설정합니다. 샘플 당 10,000의 최소 취득. 9. 데이터 분석 분석 소프트웨어 유동 세포 계측법, 및 EtBr 긍정적 인 이벤트에 대한 엄격한 게이트를 설정하여 데이터를 분석 할 수 있습니다. 비 면역 플라즈마 샘플 마이너스 % 양성 세포에 대한 EtBr + 세포의 % : 각 샘플에 대한 백분율 식균 작용을 계산합니다. 삼중에 걸쳐 평균 결과. 주 : 10 %를 초과하는 세중의 표준 편차는 실험 부정확를 나타냅니다. 몇 가지 배경 EtBr 긍정적 인 이벤트가 merozoi의 결과로 관찰 할 수있다테 THP-1 세포의 표면에 접착하지만 merozoites가 포함 된 모든 샘플에 걸쳐 일관성이 있어야합니다. 다음 컨트롤 'THP-1 merozoites없이 플라즈마 세포'제어 '비 면역 플라즈마 THP-1 세포'의 배경을 빼서에 따라 게이트 설정으로 인해 내면에 형광을 반영 % 식균 작용에서 발생합니다 / 만 merozoites을 포식.