Triage de tissus et de congélation pour les modèles de la maladie de muscle squelettique
Summary
The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.
Abstract
Le muscle squelettique est un tissu unique en raison de sa structure et de la fonction, qui nécessite des protocoles spécifiques pour la collecte de tissus pour obtenir des résultats optimaux à partir des évaluations fonctionnelles, cellulaires, moléculaires et pathologiques. En raison de la subtilité de certaines anomalies pathologiques observées dans les troubles musculaires congénitales et le potentiel de fixation d'interférer avec la reconnaissance de ces caractéristiques, l'évaluation pathologique de muscle congelé est préférable de muscle fixé lors de l'évaluation des muscles squelettiques de la maladie musculaire congénitale. En outre, le potentiel de produire de graves artefacts de congélation dans le muscle nécessite des précautions particulières lors de la congélation du muscle squelettique pour l'examen histologique qui ne sont pas couramment utilisé lors de la congélation d'autres tissus. Ce manuscrit décrit un protocole pour la congélation rapide de muscle squelettique en utilisant isopentane (2-méthylbutane) refroidi à l'azote liquide pour préserver optimale du squelette morphologie musculaire. Ce procédé est également efficace pour ftissus à des études génétiques ou protéiques expression reezing. De plus, nous avons intégré notre protocole de congélation dans une procédure plus large qui décrit également des méthodes préférées pour le triage à court terme de tissu pour (1) fibre unique des études fonctionnelles et (2) la culture de myoblastes, avec un accent sur l'effort minimum nécessaire de recueillir tissu et de le transporter à des laboratoires de recherche ou de référence spécialisés pour compléter ces études. Dans l'ensemble, ce manuscrit donne un aperçu de la façon dont le tissu frais peut être distribué de manière efficace pour une variété d'études phénotypiques et fournit des procédures d'utilisation normalisées (SOP) pour les études pathologiques liés aux maladies du muscle congénitale ainsi.
Introduction
Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation.
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models.
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le muscle squelettique est un tissu structurellement et fonctionnellement unique, et les procédures de préparation spécialisés sont nécessaires pour permettre l'évaluation optimale des paramètres structurels et fonctionnels. Bien qu'une variété de tissus sont souvent gelé pour des études pathologiques dans des contextes cliniques et de recherche, les protocoles de congélation des tissus non musculaires impliquent généralement l'immersion totale du tissu dans l'OCT avant de les congeler. Comme le montre la figure 3, un tel protocole ne convient pas pour l'évaluation pathologique des muscles squelettiques et est suffisamment similaire au protocole décrit ici qu'il s'agit d'une erreur couramment rencontré encore. Le but de ce document est de fournir un protocole simple pour la manipulation correcte du muscle pour éviter les problèmes de ce genre. Des conseils ont également été établies sur la manipulation correcte du muscle hors site physiologique et études cellulaires dans le but de faciliter l'acquisition de données de haute qualité en dehors des laboratoires de base en cas EPMre des études sur place ne sont pas préférables ou possible.
Comme indiqué dans ce protocole, les éléments qui sont absolument essentiels dans le traitement correct de muscle pour des études pathologiques comprennent en minimisant la teneur en eau du tissu, ce qui diminue la température à laquelle le muscle est congelée, et l'augmentation de la vitesse à laquelle la congélation est obtenue. Une humidité excessive dans le tissu ou la lenteur excessive du processus de congélation (produit par des températures insuffisantes ou par absence de contact direct entre l'agent de congélation et le tissu, comme cela est rencontré avec l'azote liquide) va conduire à la congélation des artefacts qui peuvent nuire à une analyse pathologique. Comme octobre fournit une source supplémentaire de l'humidité du tissu, de nombreux laboratoires utilisent d'autres adhésifs tels que la gomme adragante en tant que substrat un enrobage. Même dans les cas où le gel est effectuée de manière appropriée, il faut prendre soin d'éviter les spécimens ensuite dégeler accidentellement par contact avec des récipients ou instruments RT.Ainsi, un processus de congélation réussie exige un degré de planification qui comprend un pré-refroidissement de tous les instruments et les contenants à utiliser. Quand on rencontre des artefacts de congélation, il existe un procédé décrit ici pour la récupération du tissu qui est suffisant pour la plupart des évaluations pathologiques. Toutefois, ce cycle gel / dégel n'offre pas histologie parfait et a le potentiel de nuire à d'autres études moléculaires ou enzymatiques du tissu (en plus du temps nécessaire pour re-congeler les tissus), de sorte que l'utilisation de pratiques initiales appropriées de congélation est de loin préférable . Dans les cas où le gel artefact est rencontrée sur le tissu pré-congelé, cependant, la technique décrite ici peut être extrêmement utile.
Fixation et le traitement des tissus pour EM peut offrir des défis techniques spécifiques qui nécessitent une planification préalable à la collecte de tissus. L'erreur la plus courante lors de la collecte des échantillons pour EM implique l'utilisation de fragments de tissus qui sont trop épais pour glutaraldehyde de pénétrer. Que le glutaraldéhyde ne pénètre d'environ 0,1 cm dans le tissu musculaire d'une surface, soins donnés doivent être prises pour veiller à ce que l'une des dimensions des échantillons EM n'est pas plus épaisse que 0,2 cm. En outre, comme EM est un excellent moyen d'évaluer directement l'appareil contractile, certains chercheurs ont développé des stratégies de pré-tension ou de pré-étirement du muscle avant la fixation pour permettre la mesure des éléments contractiles à une tension physiologiquement pertinents. Il n'ya pas de protocole standard pour la pré-tension, mais deux stratégies sont brièvement décrits dans ce protocole. Il convient de noter que les tentatives de pré-tension du muscle peut produire des résultats imprévisibles, sauf si elles sont faites d'une manière très spécifique, et il peut être préférable de fixer les muscles à l'état de mou pour empêcher les modifications des artéfacts de longueur de sarcomère par un non-standard procédure de pré-tension 8,9. Pour les muscles dans lesquels ces mesures spécifiques ne sont pas nécessaires (y compris les plus biopsies réalisées à des fins cliniques), les efforts visant à pré-tension du muscle ne sont généralement pas faites, et le principal effet sur la morphologie musculaire est un espacement non uniforme des sarcomères dans le muscle.
Ce document constitue la première d'une série de fournir des SOP pour la réalisation de tests dans le domaine de la maladie musculaire congénitale, et il représente les efforts de plus de 20 experts dans le domaine de la maladie musculaire congénitale qui effectuent régulièrement cellulaire, moléculaire et fonctionnelle, physiologique et la recherche pathologique. Une gamme de modes opératoires normalisés publiés sera mis à disposition au cours de la prochaine année, et les protocoles nécessaires et les formats de publication appropriées pour chaque été discuté lors d'une Muscle maladie congénitale Consortium atelier qui s'est tenu en Avril 2013 à Washington DC Le but de cet effort de SOP est de fournir une feuille de route pour les tests nécessaires et l'analyse d'échantillons dans le domaine de la maladie musculaire congénitale à 1) normaliser les pratiques et les critères d'évaluation utilisés dans notre domaine comme mette que possible, et 2) fournir des instructions sur les pratiques normalisées pour les nouveaux chercheurs dans notre domaine. Nous croyons que ces ressources faciliter l'entrée de nouveaux chercheurs dans notre domaine sous-étudié et améliorer ainsi la portée de la recherche qui peut être réalisée. En outre, une normalisation des pratiques sera très utile pour comparer les données entre les études et d'identifier paramètres lors de la planification et de l'exécution des essais précliniques et cliniques.
Bien que l'objectif principal de cet article est lié à la congélation et à la préparation de tissu approprié pour une variété d'études, notre groupe de collaboration a également examiné les paramètres utiles pour l'analyse pathologique des échantillons de muscle. À l'heure actuelle, il n'existe aucun consensus officiel sur l'approche à adopter lors de l'exécution analyse pathologique, et une variété de différentes études sont effectuées à rapporter de nouveaux résultats de publications antérieures pour chaque maladie respective. Ainsi, nous avons pensé qu'il serait utile deproposer des lignes directrices générales pour la planification des paramètres pathologiques dans le muscle pathologie caractérisation. Avant de quantifier la pathologie dans une étude, une réflexion approfondie devrait être mis en 1) la méthode de mesure de la taille des fibres, 2) la possibilité d'anomalies fibres de type spécifique ou les effets du traitement, 3) la possibilité d'anomalies ou des effets qui sont limités de muscles individuels, et 4) une stratégie pour la quantification des résultats pathologiques qui sont caractéristiques de la maladie étudiée. taille des fibres est un paramètre nécessaire pour la plupart des études, et malheureusement, il est vaste variation dans la façon dont elle est quantifiée. De nombreuses études rapportent ces résultats en utilisant des méthodes de quantification automatiques fournies par le logiciel d'imagerie, mais beaucoup de ces programmes prennent des raccourcis (comme en supposant que les fibres sont des cercles ou ellipses) qui peuvent rendre ces mesures automatisées inexacte. Il est nécessaire de comprendre comment ces programmes automatisés font leurs mesures bvant avoir confiance dans les mesures, et nous encourager les chercheurs à inclure ces informations dans les méthodes de papier. En outre, la mesure spécifique utilisé pour désigner la taille de la fibre est extrêmement variable, et certaines mesures sont préférables à d'autres 10,11. Une mesure couramment utilisée de la taille des fibres est la superficie de la section de fibre (CSA), en particulier parce que les enquêteurs de la scène études physiologiques normaliser leurs résultats à des mesures de l'ASC obtenues à l'aide de leurs instruments. Malheureusement, alors que les mesures de la CSA peuvent refléter la taille des fibres dans les sections transversales parfaites, elles sont largement dépendants de l'orientation des fibres (dans la mesure où les fibres longitudinales ou obliquement-sectionnés auront mesures artificiellement élevés de la CSA) et sont des mesures donc pas idéal pour la taille des fibres. Une mesure préférée de la taille des fibres qui est moins dépendante de la fibre surface de section transversale est le diamètre de Feret le minimum (diamètre MinFeret), qui est la mesure de the diamètre mineur dans la cellule musculaire 12. Cette mesure est peu dépendant de l'orientation des fibres et est généralement l'étalon-or clinique pour la mesure de la fibre, et les enquêteurs sont encouragés à se déplacer vers l'utilisation de cette technique. Ces mesures peuvent souvent être faites en utilisant le même logiciel qui génère des mesures de l'ASC 13, et sont aussi faciles à mesurer manuellement. En ce qui concerne l'évaluation des données pathologiques selon le type de fibre, muscle spécifique, et dans le contexte des résultats pathologiques liés à la maladie spécifique, ce sont des questions moins controversées qui devraient simplement être considérés lors de la planification d'une étude. Type de fibre peut être évaluée en utilisant la coloration immunohistochimique ou ATPase, mais il est utile de considérer que les muscles spécifiques et d'espèces animales ont des mélanges spécifiques de ces types de fibres (nécessitant donc des attentes différentes et tester des stratégies). Muscle implication pathologique spécifique ou l'efficacité du traitementpeut se produire, et le poids total de muscle par rapport aux témoins peuvent être utilisés pour identifier le degré d'hétérogénéité de la maladie avant de décider sur les muscles pour évaluer pathologique. Enfin, il est bien connu que beaucoup de maladies musculaires sont associés à des anomalies pathologiques spécifiques (tels que les tiges de némaline dans la myopathie némaline) 14,15, et il est donc également utile d'examiner si ces anomalies sont trouvées dans une fibre musculaire de type ou spécifique de distribution lors de l'exécution de l'analyse 16,17. Dans l'ensemble, alors que nous ne proposons pas un ensemble rigide de normes pour l'évaluation des muscles, nous croyons que ces questions devraient être examinées avant la réalisation d'études pathologiques dans une maladie du muscle squelettique.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.
Materials
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| Materials | |||
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 mL conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 mL, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated Styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Reagents | |||
| Tissue Freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 mL) | Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 mL of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 mL of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| Storage requriements | |||
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications | |||
References
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