Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire
Summary
Après sectionnement de la moelle, le poisson zèbre adulte a la récupération fonctionnelle de six semaines après la lésion. Pour profiter de la transparence des larves et une récupération plus rapide, nous présentons une méthode pour sectionnant la moelle épinière larvaire. Après résection, nous observons la récupération sensorielle à partir de 2 jours après la lésion, et le mouvement C-coude de 3 jours après la lésion.
Abstract
Mammifères échouent dans la récupération sensitive et motrice après une lésion de la moelle épinière en raison du manque de repousse axonale dessous du niveau de la lésion ainsi que l'incapacité de relancer la neurogenèse vertébrale. Cependant, certains anamniotes y compris le poisson zèbre Danio rerio présentent à la fois sensible et la récupération fonctionnelle, même après section complète de la moelle épinière. Le poisson zèbre adulte est un organisme modèle établi pour l'étude de la régénération après une lésion de la moelle épinière, à la récupération motrice et sensorielle de six semaines après la lésion. Pour profiter de l'analyse in vivo du processus de régénération disponible chez le poisson zèbre larvaire transparent ainsi que des outils génétiques pas accessible chez l'adulte, nous utilisons le poisson zèbre larves d'étudier la régénération de la moelle après résection du cordon. Ici, nous démontrons une méthode pour reproductible et vérifiable sectionnant la moelle épinière larvaire. Après résection, nos données montrent récupération sensorielle début à deux jours après la lésion (ppp), l'esprith le mouvement de C-coude détectable par 3 dpi et la reprise de nage libre par 5 dpi. Ainsi, nous vous proposons le poisson zèbre larvaire comme un outil d'accompagnement pour le poisson zèbre adulte pour l'étude de la récupération après une blessure de la moelle épinière.
Introduction
Traumatisme majeur à la moelle épinière humaine se traduit souvent par une paralysie permanente et la perte de sensation au-dessous du niveau de la lésion, en raison de l'incapacité de repousser les axones ou relancer la neurogenèse 1,2. Contrairement aux mammifères, cependant, anamniotes y compris les salamandres et le poisson zèbre (Danio rerio) montrent reprise robuste, même après résection complète de la moelle épinière 3,4.
Le poisson zèbre adulte est un modèle bien établi pour étudier le processus de récupération après lésion médullaire 5-7. Après résection complète de la moelle épinière, le rétablissement de la fonction sensorielle et de la locomotive est observé chez le poisson zèbre adulte 6 semaines après la lésion 8. Afin d'examiner le processus de régénération in vivo, nous avons tourné à le poisson zèbre larvaire transparent 9.
Nous présentons ici une méthode pour sectionner la moelle épinière d'un 5 jours après la fécondation (DPF) de poisson zèbre larvaire using une pipette de micro-injection biseauté comme un scalpel, modifié de Bhatt, et al. 10 Cette méthode prend en charge un débit élevé, une faible mortalité, et la reproductibilité. Avec la pratique, 300 larves / h peut être sectionné, et plus de 6 mois transections, y compris plus de 3600 animaux, 98,75% ± 0,72% ont survécu jusqu'à 7 jours après la lésion (dpi). Nos données montrent une reprise rapide de locomotion sensorielle et ainsi: à 1 dpi, tout mouvement par les poissons blessés est entraîné par pectoral locomotion fin seulement. Cependant, les larves commencent à répondre au tungstène aiguille touche caudale à sectionnement par 2 dpi, rétablir mouvement C-virage par 3 dpi, et afficher la natation prédateur de 5 dpi 11. Utilisation de la coloration des anticorps contre la tubuline acétylée, nous avons confirmé que les axones sont absents du site de la lésion à 1 dpi, mais nous avons traversé le site de la lésion par 5 dpi. Nous croyons que ce protocole permettra une technique précieuse pour l'étude de la repousse axonale et la neurogenèse dans la moelle épinière suite à une blessure. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
Lors de l'apprentissage d'abord cette technique, nous vous recommandons d'essayer pas plus de 50-100 transections en une seule séance. Après avoir maîtrisé cette technique, nous sommes en mesure de transect de 300 embryons par heure; Toutefois, ce niveau de débit nécessite quelques mois de pratique hebdomadaire. Nous vous recommandons également de pratiquer avec une ligne de journaliste et de vérifier section complète jusqu'à ce que l'incidence de la résection incomplète de la moelle épi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes redevables à l'établissement Université de l'Utah de poisson zèbre pour l'élevage. RID a été soutenu par le NIH R56NS053897, et LKB était un stagiaire pré-doctorale soutenue par l'initiative HHMI Med-Dans-Grad.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100mm petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 ga. needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20°C |
| micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1L) | store at RT | ||
| 17.5g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10ml) | make fresh, discard extra | ||
| 0.35g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1L) | store at RT | ||
| 50ml 20x E2 | |||
| 2ml fresh 500x NaCO3 |
References
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