Technique de Subnormothermic<em> Ex Vivo</em> Foie de perfusion pour l'entreposage, de l'évaluation et de réparation des marginaux greffes du foie

Un aperçu schématique du protocole est présenté dans la figure 1. Figure 1: protocole de l'étude. L'étude de conception porcine de l'atteinte hépatique est basé sur un don après le décès cardiocirculatoire (DDC) modèle. Après dissection de tous les vaisseaux du foie, la mort cardiaque est induite suivie par 45 minutes d'échauffement greffon ischémie. Pour simuler un transport de greffe entre les hôpitaux de donateurs et bénéficiaires dans un contexte clinique, la greffe est stocké sur de la glace pendant 4 heures après le froid, à double chasse. Après un stockage à froid, l'organe est perfusé subnormothermic pendant 6 heures afin d'évaluer la stabilité de la perfusion. Dans un modèle de greffe, le temps de perfusion pourrait être plus court afin de recharger le stockage d'énergie et d'évaluer la viabilité de l'organe. S'il vous plaît cliquer ilre pour voir une version plus grande de cette figure. 1. Animaux REMARQUE: porcs mâles Yorkshire, 30-35 kg, ont été utilisés pour cette étude. Tous les animaux reçoivent des soins humains en conformité avec les «« Principes de protection des animaux de laboratoire »» formulées par la Société nationale pour la recherche médicale et le «Guide pour le soin des animaux de laboratoire» »publié par les National Institutes of Health. Le Comité de la Toronto General Research Institute de protection des animaux a approuvé toutes les études. 2. prélèvement d'organes Maison mâles Yorkshire porcs dans des installations de recherche pour 1 semaine avant la perfusion / transplantation afin de réduire le niveau de stress et pour habituer les animaux à des conditions de logement. Moins de 2 jours de logement à l'intérieur de l'installation conduiront à une réaction physique induite par le stress, ce qui peut modifier l'issue de la perfusion 22,23. Anesthésier porcspar une voie intramusculaire (im) d'injection d'un mélange de kétamine (25 mg / kg), de l'atropine (0,04 mg / kg), et de midazolam (0,15 mg / kg). Avant l'intubation, assurer le cochon respire spontanément 2 L d'O 2 dosé à 5% d'isoflurane. Vaporiser les cordes vocales avec 2% de lidocaïne 2 min avant l'intubation pour éviter les spasmes des cordes vocales. Par exemple, pour un 35 kg cochon utiliser un 6.5 fr. tube trachéal. Bloquer le tube trachéal avec 3-5 ml d'air de la pièce. Après l'intubation, utilisez capnométrie pour confirmer correct intubation. Abaissez le gaz isoflurane à 2%. Réglez le ventilateur à 14-16 respirations / min et un volume courant de 10 ml / kg de poids corporel. Placez un 20 G par voie intraveineuse (iv) cathéter dans une veine de l'oreille afin de permettre la perfusion de solution de lactate de Ringer (200 ml par heure). Puis frottez le porc et le couvrir avec des draps stériles. Faire une incision médiane suivie d'une extension latérale gauche. Utilisez une serviette pour couvrir de grandes et petites entrailles et les déplacer vers le côté gauche. Infe séparéerieur de la veine cave (IVC) et de l'aorte distale par rapport à l'autre; branches de l'aorte ligaturer à l'arrière; isoler et artères rénales gratuits de tissu adhérent. Diviser le ligament falciforme et du ligament triangulaire aide de la coagulation. Relâchez la veine porte par une incision du péritoine entre le pancréas et la veine porte. Nouez les veines de drainage du pancréas à la veine porte. Disséquer le tronc cœliaque dessous de la veine porte et de le suivre vers l'arrière à l'aorte. Entourez l'artère mésentérique avec une cravate 2-0; entourer les artères splénique et gastrique gauche, qui branche postérieure au tronc cœliaque. Disséquer le tronc cœliaque au large de la veine porte. Ligaturer les vaisseaux lymphatiques au sein de l'épiploon pour empêcher une fuite lymphatique. Diviser l'artère gastrique droite entre les liens. Ligaturer les petites veines. Séparer la voie biliaire du ligament et le diviser distale après la ligature. Disséquer l'aorte derrière la membrane entre le cœur et coeliaque trunk; placer une cravate 2-0 autour de l'aorte. Relâchez le foie de la veine inférieure sur le côté droit en utilisant la cautérisation électro; utiliser des ciseaux pour la partie supérieure entre cave et le foie. Retirer la vésicule biliaire et cautériser les purgeurs de lit de la vésicule biliaire. Administrer iv 1000 UI / kg de poids du donneur de l'héparine. Pour un modèle DCD, provoquer un arrêt cardiaque par injection intracardiaque de 40 mEq de KCl 3 minutes après l'administration d'héparine. Arrêt cardiaque définir comme point d'ischémie chaude de départ. Pour la perfusion, de recueillir 1,6 L de sang de porc dans des sacs CPDA (citrate, phosphate, dextrose, l'adénosine) immédiatement après la mort cardiaque. Effectuer un lancement douce (2000 xg sans frein). Retirez le plasma et la couche leuco-plaquettaire dans des conditions stériles (biosécurité de classe II armoire) et stocker les érythrocytes en CPDA sacs pour transfusion. Cathétériser veine porte et de l'aorte avec des lignes de chasse d'organes. Nouez les liens déjà établis autour du fémur, rénale, splénique, mésentérique, et l'art gastrique gaucheé rie ainsi que l'aorte supérieure. Pour un modèle cœur battant donneur (DBC), effectuer la ponction de l'aorte et la veine porte dans des conditions de battement de coeur. Après 45 minutes d'ischémie chaude, rincez le foie avec l'Université du Wisconsin (UW) solution utilisant double perfusion par l'aorte (sac de pression) et la veine porte (par gravité). Couper le foie du porc, laissant tous les navires restants de long. Lors de la préparation de back-table, serrer la VCI supérieur à l'aide d'une pince Satinsky et rincer le foie une deuxième fois avec environ 0,5 L de solution UW rétrograde par IVC inférieure jusqu'à ce que la sortie de la veine porte est clair. Nouez les branches artérielles de l'aorte et du tronc coeliaque. Effectuez une pression artérielle perfusion retour table avec environ 0,5 L de solution UW. Rincer la voie biliaire en utilisant la solution UW. Cathétériser les parties supérieure et inférieure de la veine cave inférieure en utilisant 1/2 "x 3/8" Luer Lock avec réducteurs; cathétériser la veine porte et l'artère hépatique par 3/8 "; x 1/4 "et 1/4" x 3/8 "avec réducteurs Luer Lock. Utilisez la veine cave supérieure et inférieure comme le drainage veineux. Placer le foie dans un sac d'organes, fermer le sac d'organes, et stocker le foie sur la glace jusqu'à ce que la perfusion a commencé. 3 Liver perfusion ex vivo Préparer la solution de perfusion contenant une solution de 2,000 ml Steen, 400 ml lavé les erythrocytes, 550 pyruvate de sodium mg, 100 ml aminés solution acide (10% Travasol), 10 mg de gluconate de calcium, 1,000 IE action rapide de l'insuline, de 1 g de céfazoline, 500 mg de métronidazole, et 10 000 UI d'héparine. Ajouter d'autres molécules pour la vasodilatation, l'immunosuppression, la récupération des espèces réactives de l'oxygène, ou le traitement de cellules de foie sur la base du protocole de l'étude particulière. Pour la composante de dialyse, utilisez dialysat standard contenant 3,5 potassium mM, bicarbonate 25, 27 mM de glucose, ainsi que 275 mg / L de pyruvate. Mettre en place le circuit de perfusion (schéma voir Figure 2). Figure 2 Circuit mis en place. Venant du réservoir principal comme le point de départ et à la fin, la solution de perfusion est entraînée par une pompe centrifuge à travers un oxygénateur. Immédiatement après l'oxygénation de la solution, le circuit se sépare en une ligne plus petit fonctionnant à une unité de dialyse pour l'homéostasie électrolyte et une plus grande ligne allant à un filtre de leucocytes pour la réduction du nombre de globules blancs (WBC) restantes. La solution qui traverse le dialyseur retourne vers le réservoir principal. Après la filtration des leucocytes, le circuit se sépare à nouveau en deux lignes égales. Une ligne fonctionne à haute pression (environ 60 mmHg) directement dans l'aorte à l'artère hépatique perfuser. L'autre ligne se déverse dans un second réservoir. De ce réservoir de la veine porte est perfusé. La pression de la perfusion portale dépend de l'énergie de l'élévation du niveau de la solution de réservoir (environ 2-6 mm de Hg). Tous les liquides sont drained via l'infrastructure et supra-hépatique veine dans le réservoir principal. Pour la réduction de la gravité et de la perfusion homogène, le foie est placé dans une piscine remplie d'eau à température régulée. Il est séparé de l'eau par une membrane imperméable et il nage dans une suspension de perfusion. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Recueillir tous les fluides du circuit dans un 3 L réservoir (réservoir principal) et serrer la sortie. Connectez la sortie à une pompe centrifuge suivie par un oxygénateur commerciale. Derrière l'oxygénateur, diviser le tube en 2 lignes. Connectez une ligne à un dialyseur et égoutter dans le réservoir principal. Connectez le deuxième ligne à un filtre de réduction des leucocytes. Scinder la ligne en aval du filtre de réduction des leucocytes dans une ligne artérielle, qui fournit une solution de perfusion de l'artère hépatique, et un portail vligne voir local distribuer la solution de perfusion à un second réservoir, qui se jette dans la veine porte par gravité sortie. Fixer l'entrée du portail. Connectez la ligne artérielle à une ligne de la veine cave se déverse dans le réservoir principal de recueillement fluide. Pour la collecte de l'ascite ou de fuite de solution de perfusion à partir du foie, préparer une conduite d'aspiration reliée au réservoir principal. Relâcher la pince de sortie du réservoir principal et remplir le circuit avec la solution de perfusion. Démarrer la pompe centrifuge à 1500 tours / min. La solution de perfusion sera de traverser la ligne artérielle dans la ligne de la veine cave dans le réservoir principal. Assurez-vous que tout l'air est chassé du circuit. Ouvrir l'alimentation de gaz à l'oxygénateur. Sortez le foie hors de la glace. Rincer la solution UW utilisant une solution saline. Placer le foie, avec son côté convexe vers le bas pour faciliter l'accès aux navires, de préférence dans un environnement sans pesanteur, afin d'évitercompression d'organes à la surface de contact. Utilisez un bain d'eau à la chaleur et pouvant être refroidi. Régler la température à partir du bain de circuit et de l'eau à 20 ° C. Couvrir le bain d'eau avec une membrane imperméable et placer le foie sur cette membrane. Réduire la gravité compression conduit en immergeant le foie avec une solution de perfusion. Réduire la vitesse de la pompe centrifuge à 1000 tours / min et placer deux pinces à la connexion de artériels et veine lignes de cava. Ensuite, coupez le tuyau entre les pinces. Utilisation d'un connecteur à 3 voies, joindre les deux sorties cava et de les relier à la ligne de la veine cave. Dégagez le collier de la ligne artérielle, verser la solution de perfusion dans la canule artérielle de se débarrasser de bulles, et relier la ligne à la canule. Augmenter la pompe centrifuge à 1500 tours / min. Relâchez la deuxième pince de la ligne de la veine cave. Relâchez le collier du réservoir veineux portal pour le remplir. Laissez la solution de perfusion verser dans le Cannu portailla et branchez-le. Faites attention de niveaux de liquides stables dans le réservoir du portail. Connectez lignes de pression pour les serrures Luer des canules artérielle, portail, et la veine cave. Pour reproduire les conditions physiologiques, appliquer des traitements dans le droit navire. Injecter glucose dans la veine porte et non dans la ligne artérielle afin d'établir un gradient imitant un portail gradient de glucose veineux et induisant une augmentation de la synthèse du glycogène 24,25. Après avoir relié le circuit à la foie, élever la température à 33 ° C dans les 60 min. But pour un départ flux artériel à environ 250 ml / min à 40 mmHg. Cela peut atteindre 700 ml / min au cours de la perfusion une fois que la pression est augmentée jusqu'à 70 mmHg. À la température de départ, viser un flux de veine porte de 500-600 ml / min à 3-5 mmHg. Après élévation de la température, surveiller le flux veineux portal, qui augmentera jusqu'à 1100 ml / min à 4-6 mmHg. Evitez de dépasser la pression portale ci-dessus Physiological valeurs (environ 8 mmHg) pour protéger fenestrations sinusoïdales 26. Evitez de dépasser le débit total supérieur à 2000 ml / min afin d'éviter d'endommager l'organe. Régler la sortie de -2 mmHg en abaissant le réservoir principal pour éviter la congestion du foie par l'obstruction de sortie fonctionnelle. Ajouter le composant de dialyse dans le circuit afin d'équilibrer la solution de perfusion 27 à des valeurs prédéterminées. Régler le débit de dialysat de 500 ml / h. Prendre une attention particulière à ajuster le débit de dialyse de sorte que la solution de perfusion est ni dilué ni concentrée. Dans la première heure de perfusion au réservoir principal doit être visionnée attentivement! D'assurer une oxygénation du tissu homogène pour récupérer et maintenir la fonction des organes à l'aide d'un composant principal d'un mélange gazeux de O 2 (95-98%) et de CO 2 (2-5%). Utilisez gaz variable au cours de la perfusion depuis le foie modifie son métabolisme et sa demande de pH pendant la perfusion. Maintenir un pH bas pendant le démarrage deperfusion pour protéger l'organe en utilisant le concept paradoxe de pH 28 et d'éviter de graves lésions tissulaires qui peuvent résulter d'une connexion rapide à pH physiologique sous la réoxygénation, puisque, après stockage dans la solution UW, l'organe a un pH acidose inférieur à 7 Régler la pression partielle de CO 2 en continu vers le bas à 25-30 mmHg sorte que le pH atteigne un niveau physiologique à 1 h. Ajouter le bicarbonate de sodium ou de potassium dans le circuit pour obtenir une concentration physiologique de bicarbonate standard dans la solution de perfusion. Injecter le délicatement sous un gaz du sang répétitif et le contrôle de l'électrolyte. Surveiller la perfusion par périodique des gaz du sang veineux et artériel et AST analyses. La PO 2 veineuse reste au-dessus de 175 mmHg au cours de la perfusion. Contrôler le débit et la pression vasculaire et noter une perfusion stable par une résistance vasculaire constante. Gardez le système de perfusion stable jusqu'à 8 h. A la fin de la période d'ex vivo la perfusion, coolle système de perfusion à 20 ° C et, après avoir débranché le tuyau de circuit à partir du foie, rincer la solution de perfusion sur le foie doublement avec une solution glacée de UW froid. Conservez le foie une fois de plus mis sur la glace dans un sac d'organes stérile.