JoVE Journal > Immunology and Infection
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Abstract
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Protocol
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Discussion
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Materials
References
면역학 및 감염병학

Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

Published: July 02, 2014
doi:
10.3791/51410
, , ,
1Genetics and Genomic Sciences Graduate Program,University of Alabama at Birmingham, 2Birmingham Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Pathology,University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering,University of Alabama at Birmingham, 5Department of Medicine,University of Alabama at Birmingham

Summary

Um método de quantificação da aderência de neutrófilos é relatado. Este método cria um ambiente dinâmico de fluxo semelhante ao encontrado em um vaso sanguíneo. Ele permite a investigação de adesão de neutrófilos, quer moléculas de adesão purificadas (ligando) ou substrato de células endoteliais (HUVEC) num contexto semelhante ao ambiente in vivo com tensão de cisalhamento.

Abstract

Firme adesão de neutrófilos às células endoteliais desempenham um papel crítico na inflamação na saúde e na doença. O processo de adesão firme dos neutrófilos envolve muitas moléculas de adesão diferentes, incluindo membros da família integrina β 2 e respectivos contra-receptores da família ICAM. Recentemente, de ocorrência natural em ambas as variantes genéticas β 2 integrinas e ICAMs são relatados para ser associada com a doença auto-imune. Assim, a capacidade adesiva quantitativa de neutrófilos de indivíduos com diferentes formas alélicas destas moléculas de adesão é importante para estudar em relação aos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de auto-imunidade. Estudos de adesão dos sistemas de câmara de fluxo pode criar um ambiente com tensão de corte de fluido semelhante ao observado no meio de vasos sanguíneos in vivo. Aqui, apresentamos um método que utiliza um sistema de ensaio de câmara de fluxo para estudar as propriedades adesivas quantitativas de neutrófilos no sangue periférico humanos de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e substratos de ligandos purificados. Com este método, as capacidades adesivas de neutrófilos a partir de doadores com diferentes variantes alélicas de receptores de adesão pode ser avaliada e comparada. Este método também pode ser modificado para avaliar a adesão de outros tipos de células primárias ou linhas celulares.

Introduction

Variantes genéticas em ambos β 2 integrinas e em ligandos ICAM são reconhecidos agora a ser associada com o desenvolvimento de doença auto-imune 1,2. A determinação das consequências funcionais destas variantes em células derivadas de indivíduos com essas variantes é necessário para a nossa compreensão de como essas variantes contribuir para a patogênese da doença auto-imune. Tais estudos funcionais permitir a determinação dos mecanismos através dos quais ocorrem naturalmente, variantes genéticas moldam a resposta imune na saúde e na doença. No exemplo específico de LES, agora sabemos que as variantes em ITGAM (CD11b) e seu ligante, ICAM-1, associam fortemente com o desenvolvimento da doença 1,2. Porque neutrófilos são críticos em respostas inflamatórias, o estudo quantitativo de adesão de neutrófilos pode fornecer insights sobre como os mecanicistas variantes genéticas em ITGAM / ICAM alterar a inflamação.

NeutropHil adesão firme às células endoteliais (CE) é um processo altamente regulado e desempenha um papel essencial na resposta inflamatória 3,4. A adesão firme dos neutrófilos segue rolando neutrófilos inicial e captura no CE e, finalmente, pode resultar em transmigração in vivo. Estes processos envolvem vários tipos diferentes de moléculas de adesão, incluindo ICAM-1, ICAM-2, P-selectina, E-selectina em células endoteliais e β 2 integrinas na neutrófilos 5-9. Assim, a quantificação cuidadosa de adesão de neutrófilos de doadores com diferentes variantes alélicas de moléculas de adesão será importante para compreender as conseqüências funcionais e patológicas dessas variantes genéticas.

O uso experimental de uma câmara de fluxo pode criar um ambiente in vitro, com a tensão de corte de fluido semelhante ao observado no meio de vasos sanguíneos in vivo de 10-12. De facto, um ensaio de câmara de fluxo acoplado com umbili humanocal de células endoteliais de veia (HUVEC) podem simular o ambiente in vivo de um vaso sanguíneo. Usando este método, é possível estudar as propriedades adesivas celulares globais em direção das células endoteliais. Além disso, o ambiente altamente controlado da câmara de fluxo, também permite a avaliação da ligação de células a ligandos de adesão purificadas, tais como ICAM-1 a fim de facilitar o estudo da interacção receptor-ligando específicas.

Apresentamos aqui um método que utiliza um sistema de ensaio de adesão de câmara de fluxo para estudar as propriedades adesivas de neutrófilos de sangue periférico humano a HUVEC e a substratos de ligandos purificados. Usando este método com células de doadores que expressam diferentes variantes da molécula de adesão alélicas nos permite avaliar como essas variações genéticas podem alterar humano adesão firme dos neutrófilos.

Protocol

Todos os doadores recrutados para este estudo deu consentimento informado escrito eo estudo foi aprovado pela Universidade de Alabama em Birmingham Institutional Review Board. 1. HUVEC Cultura Inicial e Subcultura Cultura das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) in vitro em meio de crescimento completo, que é composta de meio basal de células endoteliais (ver Lista de Materiais) suplementado com factores de crescimento de células endoteliais. Nota: Os factores de crescimento utilizados neste estudo incluem: 5 ng / ml de recombinante humano do Factor de Crescimento Epidérmico (hEGF), 1,0 mg / ml de hidrocortisona, 50 mg / ml de gentamicina e 50 ng / mL de anfotericina-B (GA-1000), 2 % de soro fetal bovino (FBS), 0,5 ng / ml de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), 10 ng / mL de Factor de Crescimento de Fibroblastos-básico com heparina (hFGF-B), 20 ng / ml de factor humano recombinante humana Insulin-like Growth ( R3-IGF-1), 1 ug / ml de ácido ascórbico, e 22,5 ug / ml de heparina. O meio completoé preparado inicialmente a 37 ° C e, em seguida, pode ser armazenado a 4 ° C para utilização no prazo de um mês de preparação. Para preparar um frasco de células, meio de crescimento completo é adicionada a um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros 2 (1 ml / 5 cm 2) e, em seguida, o balão é deixado a equilibrar a 37 ° C / 5% de CO 2, num incubador humidificado durante , pelo menos, 30 min. HUVEC humana serão semeadas directamente neste frasco de cultura equilibrado a uma densidade de 2,500-5,000 células / cm 2. Enquanto a mídia está equilibrando, descongelar rapidamente o estoque cryovial HUVEC em banho-maria 37 ° C. Dispersar as células no frasco de armazenamento original por vórtex e, em seguida, adicioná-los directamente para o frasco de cultura contendo o meio de crescimento completo HUVEC pré-equilibrada para atingir uma densidade de 2,500-5,000 células / cm 2. Agite suavemente o frasco para distribuir uniformemente as células e, em seguida, devolver o frasco para a incubadora. Estas células representam agora a passagem 1 º. <li> Médio deve ser trocado a cada dois dias até que as células são de 70-80% confluentes. O HUVECs pode agora ser colhidas a partir do balão de cultura com tripsina / EDTA. O meio de cultura foi aspirado a partir dos frascos de cultura, seguido por uma lavagem com PBS, para remover qualquer proteína residual e de cálcio das células. Uma solução de Tripsina-EDTA a 0,25% é adicionado e dentro de 2-6 min desprendimento de células deve ser evidente, tal como avaliado através de microscopia de luz. Quando 90% das células são arredondadas para fora da placa, parar a tripsinização adicionando um volume igual de 2x inibidor de tripsina. Para facilitar a colheita de células, adicionar uma outra quantidade igual de meio de crescimento completo. Transferir as células destacadas para um tubo de centrífuga de 15 ml estéril. Centrifugar as células isoladas a 225 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante, e, em seguida, voltar a suspender as células em 2-3 ml de meio de crescimento completo. Determinar a concentração de células e viabilidade utilizando um hemocitômetro e azul de tripano. Para utilizar ªe células para estudo, re-semente adicional 75 centímetros 2 frascos com células a uma densidade de 10.000 células / cm 2 colhidas e vá para o passo 2.2. Alternativamente, as células podem ser congeladas neste ponto para estudos futuros. Para congelamento celular, sedimentar as células por centrifugação a 225 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em FBS contendo DMSO a 10% a uma concentração de 1 x 10 6 células / ml. A suspensão de células é então transferido para criotubos e armazenou-se a -80 ° C após o congelamento das células em um recipiente de congelamento celular. 2. Preparação HUVEC Camada Uso de congelados HUVECs passagem 2 ª: renascimento e da cultura. Se o uso de células em crescimento activo, siga para o passo 2.2. Descongele o cryovial contendo 2 ª HUVECs passagem do passo 1.8 rapidamente em banho-maria 37 ° C. Células Transferência do cryovial para um tubo de centrífuga de 15 ml estéril e adicionar 10 ml de crescimento medium. Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante para remover o DMSO residual. Ressuspender o sedimento de células com meio de crescimento completo e transferência das células para um frasco de 75 cm 2. Adicionar meio de crescimento para um volume total de cerca de 20-25 ml e incubar a 37 ° C / 5% de CO 2. Examine visualmente a cultura de células em confluência cada dia com as mudanças de mídia a cada dois dias. Normalmente dentro de 2-4 dias, as células atingem 80-90% de confluência, altura em que estará pronto para a utilização no ensaio de câmara de fluxo. Para preparar o prato de cultura que vai ser utilizado na câmara de fluxo (ver secção 5), adicionar 1 ml de 10 ug / ml de fibronectina e de 0,05% (w / v) de gelatina a de 35 mm de cultura de tecidos e louça pipeta várias vezes para fazer Certifique-se de toda a placa de superfície é revestida. Remover a solução de fibronectina e gelatina excessiva e secar a placa pelo menos durante 30 minutos para optimizar a formação de uma matriz de proteínas. O fsolução ibronectin e gelatina pode ser reutilizada até 10 vezes. Colher as células HUVEC do passo 2.2 utilizando tripsina-EDTA como descrito nos passos de 1,5-1,7. Semente 500.000 células em cada tecido revestido cultura prato. Adicionar 2 ml de meio de crescimento em cada placa e incubar a 37 ° C / 5% de CO 2. Permitir que as células crescer até à confluência, como no passo 2.2. As células devem ser inspeccionados visualmente diariamente com alterações médias a cada dois dias. Antes do ensaio de câmara de fluxo, primo da HUVEC com 20 ng ml de TNF-α humana / de 4-6 horas para regular positivamente e estimular a expressão da adesão molecular. 3. Purificada Ligand Coating Desenhar um círculo de 0,5 cm de diâmetro com um marcador ou uma caneta no centro de 35 mm de cultura de tecidos prato. Placa 20 ul de 20 ug / ml de proteína A na área marcada. Use a ponta da pipeta para espalhar a proteína A solução para cobrir toda a área dentro do círculo 0,5 centímetros de diâmetro. É importante não tocar ou arranhar a superfície do dish. Incubar a 37 ° C durante 1 hora. Lavar as proteína-A revestidos 3x placa com 1 ml de PBS (pH 8,0). Placa 50 ul 1% de BSA na área demarcada para bloquear a ligação não-específica na placa. Incubar durante 2 horas a 4 ° C. Lavar as 3x placa bloqueados com 1 ml de PBS, como no passo 3.3. Preparar as soluções de proteínas quiméricas do ligando do receptor de Fc-aderência para revestimento. Nesta experiência, uma solução de ICAM-1/Fc quimera, a 25 ug / ml e uma quimera P-Selectin/Fc a 0,5 ug / ml em PBS (pH 8,0) foi usado. Revestir a área marcada com 50 ul de substrato. Incubar durante a noite a 4 ° C. O prato deve ser usada dentro de dois dias e a área de revestimento não devem ser deixadas a secar fora. Adicionar PBS, se necessário, para manter a solução de 50 mL na placa. 4. Separação de neutrófilos (Todos os passos realizados na temperatura ambiente) Após a obtenção do consentimento informado, coleta de sangue por flebotomia participante em umn anticoagulante tubo de coleta de sangue ou vacutainer (EDTA ou heparina). Após a coleta de sangue, diluir a 1:01 sangue com PBS antes da separação. Prepare uma de duas camadas Ficoll para separar PBMC e neutrófilos em 50 ml tubos de centrífuga. Primeiro adicione 15 ml de Ficoll pesado (veja Lista de Materiais, ρ = 1,118-1,120), e depois com cuidado a camada 10 ml luz Ficoll (ver Lista de Materiais, ρ = 1,077-1,080) em cima do pesado Ficoll. Deve haver uma fronteira nítida entre o Ficoll luz e camadas de Ficoll pesados. Finalmente, a camada cuidadosamente 25 ml da amostra de sangue diluído no topo do Ficoll luz sem perturbar a camada de Ficoll. Centrifuga-se o tubo a 250 xg durante 30 min à temperatura ambiente. Nota: O freio de rotor da centrifugadora deve ser desligado para estas rotações para minimizar potencial ruptura da separação de células durante a desaceleração do rotor, no final da centrifugação. Após a centrifugação, as seguintes camadas (de cima para baixo) estão presentes: a camada superior é o seguin plasmawed pela camada de PBMC no topo da camada de Ficoll luz, a camada de neutrófilos com poucas células vermelhas do sangue (RBC) é entre a luz e Ficoll pesada seguido pela camada de Ficoll e pesado GVs na parte inferior do tubo. Colheita e transferir a camada de neutrófilos para um novo tubo de 50 ml com uma pipeta de transferência, adicionar PBS a um volume final de 50 ml e centrifugar a 225 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Após centrifugação, ainda pode haver GVs misturados com os neutrófilos. Aspirar o sobrenadante até à marca de 10 ml. Ressuspender o sedimento de neutrófilos-RBC por agitação suave do tubo (ou um breve vórtice a baixa velocidade) e, em seguida, lavar novamente com 50 ml de PBS. Após a segunda lavagem, aspirar o sobrenadante. Para remover os glóbulos vermelhos contaminantes, ressuspender as células peletizadas em PBS residual por meio de agitação (ou curto vórtice), adicionar 25 mL de H2O e suavemente vórtice durante 10 segundos para lisar os glóbulos vermelhos. Adicionar 25 ml de NaCl 1,8% e misture imediatamentepor centrifugação a 225 xg durante 10 min à temperatura ambiente. O RBC contaminando agora devem ser lisadas deixando um neutrófilos pellet de células brancas. Lava-se a pelete de células de neutrófilos com PBS. Ressuspender as neutrófilos isolados em meio RPMI com 10% de FBS e determinar a concentração de células em microscópio de luz com um hemocitómetro. Ajustar a densidade de células a 500.000 células / ml com meio RPMI completo, 10% de FBS. 5. Fluxo Secção Ensaio de Adesão Monte a câmara de fluxo. Coloque o prato de 35 mm contendo as HUVEC confluentes ou ligandos de receptores de adesão purificadas sobre a mesa de microscópio. Ligue a câmara de fluxo de placas paralelas com bomba de seringa, sistema de vácuo e deixar uma linha aberta para a entrada de neutrófilos. Inserir a câmara de fluxo no topo da placa e fixar o conjunto da câmara de escoamento 13. (Ver Figura 1) Inicie o programa de gravação de vídeo no computador conectado to microscópio. Ajustar o campo e foco do microscópio até um campo claro com células HUVEC totalmente crescidas ou um domínio dentro da região de revestimento ligante é visível. Usando a bomba de seringa, lave a câmara de fluxo com meio RPMI. Certifique-se de que não há bolhas de ar no interior da câmara ou a linha de entrada de neutrófilos. Se desejado, os neutrófilos podem ser preparadas com uma dose baixa (10 -8 M) fMLP durante 10 min. Isto vai permitir uma correspondência entre o nível basal de activação dos neutrófilos entre diferentes doadores 14. Utilizar a bomba de seringa para injectar os neutrófilos para a câmara de fluxo a uma velocidade definida (uma velocidade de 350 mL / min, o que equivale a uma tensão de corte de 1,5 dines / cm 2 é utilizada neste estudo). Grave o vídeo. Porque a adesão de neutrófilos pode ocorrer rapidamente, um vídeo com uma duração de 4-5 minutos é geralmente suficiente para quantificar os eventos de adesão para análise. Uma célula aderente é definida como uma célula que se move menos do que um diâmetro da céluladentro de 5 seg em HUVEC ou ligando de superfície revestida 15,16. Contar o número total de células aderentes no campo presente no vídeo gravado utilizando esta regra. Ao gravar vídeos de comprimento semelhantes com neutrófilos de doadores diferentes, pode-se calcular o aderente células / min para comparar as propriedades de adesão entre os diferentes doadores.

Representative Results

Exemplos de ligação de neutrófilos para um ligando purificado (ICAM-1/P-Selectin) câmara de fluxo revestida (Figura 2) ou de ligação a um ensaio de câmara de fluxo revestida HUVEC (Figura 3) neutrófilos são mostrados. Como mostrado nas figuras, os neutrófilos continuam a acumular / aderir à superfície revestida ou HUVEC sob condições de fluxo contínuo. Nas nossas condições típicas da experiência, podemos observar 50-70 neutrófilos humanos firmemente aderem à superfície revestida ou HUVEC durante um período de gravação de quatro minutos. No entanto, variantes alélicas das moléculas de adesão de neutrófilos, ou variantes alélicas do substrato (ligando purificado ou HUVEC), poderia alterar substancialmente a adesão de neutrófilos quantitativa 14. Também se avaliou a dependência do tempo de acontecimentos de adesão de neutrófilos observado nos nossos estudos. Enquanto que mantêm as condições de fluxo constante, é possível que as propriedades adesivas das células mudam ao longo do tempo. However, ao longo dos cursos de tempo relativamente curtos em nossos estudos, não observamos diferenças consistentes na taxa de adesão ao longo do tempo. Por exemplo, avaliar a adesão nos pontos de tempo 1-2 minutos em relação a aderência observada entre os 3-4 pontos no tempo mínimo não são consistentemente diferente. É claro que, se as células estão a ser estimulado durante a experiência de adesão, em seguida, as alterações nas propriedades adesivas ao longo do tempo poderia ser esperado. Nos nossos estudos, controlado por isolamento da activação dos neutrófilos induzida por intencionalmente priming as células com baixa dose de fMLP (10 -8 M) durante 10 minutos antes do estudo. As células endoteliais (HUVEC em nossos estudos) também necessitam de ativação antes de upregulate molécula de adesão expressão para melhor adesão firme dos leucócitos. Na ausência de pré-tratamento, as células endoteliais (HUVECs) vai apoiar muito pouca aderência de neutrófilos. Nos nossos estudos, utilizou-se 10 ng / ml de TNF para o tratamento de 4-6 horas antes de utilizar. IL-1β (10 ng / ml) e LPS (0,5-1 ug / ml) também pode ser utilizado para pré-activar as células endoteliais. Importante, as HUVEC não tratada pode ser utilizada como controlo negativo para assegurar que a adesão das células é causada por específico interacções celulares de neutrófilos-endotelial (mediada por receptores). Alternativamente, os anticorpos anti-receptor podem ser utilizados para bloquear os receptores específicos para avaliar a especificidade de adesão. Configuração câmara Figura 1. Fluxo no palco microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. oad/51410/51410fig2.jpg "/> Figura 2 tiros de tela de um vídeo de amostra de neutrófilos que aderem a ICAM-1/P-Selectin superfície revestida em momentos diferentes (A:. 0 ponto de tempo, B: 1 ponto min tempo, C: 2 min ponto do tempo, e D: intervalo de 4 min). A concentração de ICAM-1 é de 25 ug / ml e P-selectina é de 0,5 ug / ml. Velocidade do fluxo de neutrófilos é de 350 ul / min com a densidade de neutrófilos em 500.000 células / ml. Tiros Figura 3 Tela de uma amostra de vídeo de neutrófilos que aderem à superfície de HUVEC revestidos em diferentes pontos de tempo (A: 0 ponto de tempo, B: 1 min de ponto de tempo, C: 2 min ponto do tempo, e D: Ponto de tempo de 4 min)..Velocidade do fluxo de neutrófilos é de 350 ul / ml, com a densidade de neutrófilos em 500.000 células / ml. Espécies Localização Tensão de cisalhamento (dinas / cm 2) Humano Artéria caroid comum 11,6 Humano Artéria branquial 6.5 Humano Artéria femoral comum 4.3 Humano Aorta supra-renal 7.3 Humano Aorta supracelíaco 4.2 Humano Artéria fermoral Superficial 4.4 Humano Vênulas 0,5-5,0 Humano Retina primeiros arteríolas 40,2 Humano Segundo arteríolas da retina 0,001 Humano Retina primeiros vênulas 23,2 Humano Segundo vênulas da retina 0,43 Cão Artéria caroid comum 15,8 Coelho Artéria caroid comum 23,3 Rato Artéria caroid comum 46,6 Mouse Artéria caroid comum 64,8 Cão Artéria femoral comum 9,8 Coelho Artéria femoral comum 156,8 Rato Artéria femoral comum 65,9 Amostra estresse Tabela 1. Cisalhamento em diferentes órgãos e espécies diferentes. * Sintetizada a partir de referências 13, 16, 19 e 20.

Discussion

Este protocolo orienta a separação e isolamento de neutrófilos ativados minimamente para a quantificação cuidadosa de adesão de neutrófilos sob condições de estresse pura. Adesão de neutrófilos é um processo crítico em inflamação. Porque variantes genéticas em várias moléculas neste processo têm sido demonstrados para predispor ao desenvolvimento de doença auto-imune 1,2, um sistema de ensaio capaz de avaliar quantitativamente humano firme adesão de neutrófilos é necessária. O método descrito neste protocolo permite a determinação cuidadosa e quantitativa do potencial adesiva firme de neutrófilos num ambiente controlado in vitro sob tensão de cisalhamento. Este método permite, assim, a comparação direta de adesão de neutrófilos quantitativa entre indivíduos genotipados para determinar a importância da variação genética em moléculas de adesão 14.

Diversas etapas deste método merecem consideração cuidadosa para alcane resultados altamente reprodutíveis e quantitativos. Na preparação de HUVEC, que é fundamental para atingir 100% de confluência de células antes de utilizá-los na câmara de fluxo. Para utilizar as superfícies revestidas com ligando purificado, a área do revestimento de substrato nunca deve ser deixado secar ao evitar a desnaturação do ligando. Além disso, a preparação de neutrófilos humanos é crítico para o sucesso da experiência. As questões fundamentais em isolar os neutrófilos a partir de sangue incluem manipulação suavemente minimizando vórtex para evitar a activação, mantendo as células à temperatura ambiente (isto é, o sangue não deve ser armazenado em gelo e centrifugação passos devem ser realizados à temperatura ambiente) e completando o isolamento e a experiência no menor espaço de tempo possível. Há métodos adicionais de isolamento de neutrófilos que também podem ser utilizados para preparar as células para estes ensaios 17,18.

A partir de uma perspectiva prática ensaios, de adesão utilizando neutrófilos humanos recém-isoladas deve ser iniciada dentro de 3-6 horas após a participante flebotomia. Como os neutrófilos são extremamente sensíveis à manipulação, tempos prolongados entre a coleta de sangue e uso podem afetar os resultados do ensaio. Determinação cuidadosa da concentração de células de neutrófilos antes do ensaio de câmara de fluxo é também necessária para alcançar resultados precisos e reprodutíveis.

Durante o ensaio de câmara de fluxo, é importante controlar a gravação de vídeo com cuidado para garantir que a velocidade de fluxo é constante e não há nenhuma turbulência durante toda a duração da experiência. As alterações nas velocidades de fluxo ou a presença de turbulência, seria necessário que o experimento ser repetido. Após a experiência, que também é importante para avaliar os neutrófilos restantes microscopicamente para assegurar que os neutrófilos não estão aglomerem. Aglomeração neste ponto que indicaria que os neutrófilos ativados se tornaram o que pode alterar significativamente a densidade de neutrófilos durante o experimento.

conteúdo "> A câmara de fluxo cria uma tensão próximo homogénea pura dentro da câmara (τ = 6Qμ / (wh 2), onde Q = caudal, μ = viscosidade dinâmica, e w = largura da câmara de fluxo, h = altura da câmara de fluxo 15). Nos nossos estudos, utilizou-se uma taxa de fluxo de 350 mL / min para a adesão de neutrófilos, o que cria uma tensão de cisalhamento de 1,5 dines / cm 2 (w = 0,25 cm, h = 0,01 cm, a viscosidade da água a 37 ° C (0,007 poise) foi usado como uma aproximação da viscosidade dos meios RPMI). Para uma câmara de fluxo específico, pode-se alterar a taxa de fluxo para atingir diferentes níveis de tensão de cisalhamento para simular diferentes condições fisiológicas. shear stress fisiológico típica em vasos sanguíneos humanos pode varia entre 0,5-5,0 dyne / cm 13,16. Tensão de cisalhamento em outros vasos sanguíneos e outros animais foram listadas na Tabela 1 113,16,19 20.

Enquanto o nosso método tem-se centrado no estudo da adesão de neutrophi humanols, este método não se limita aos neutrófilos e pode facilmente ser aplicado a estudos de adesão ou de rolamento de outros tipos de células, com modificações simples. Além disso, os substratos neste método pode ser modificado para fins diferentes.

Embora este protocolo é facilmente adaptável a diferentes estudos, existem algumas limitações. O protocolo como implementado aqui requer grande número de células primárias para análise. Isso pode impedir a análise de células primárias de pequenos animais. Além disso, a necessidade de imobilizar ligandos de adesão purificadas numa conformação activa / disponíveis podem limitar a gama de ligantes. A utilização de proteínas de fusão Fc-aumenta grandemente as possibilidades de conseguir a conformação do ligando apropriado sobre a superfície da placa. No entanto, o nosso método não tem uma flexibilidade significativa para permitir a análise quantitativa de eventos de adesão. Estes estudos irão melhorar muito a nossa compreensão de pares receptor-ligante de adesão, bem como a importância da função potencial de variantes genéticasnestas proteínas, na patogénese de doenças humanas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é patrocinado pelo Instituto Lupus Research (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 e NIH UL1-TR00165. Agradecemos ao Dr. Robert P. Kimberly por seu apoio contínuo.

Materials

Table of Reagents Materials
Name of reagent Company Catalogue number Comments
0.25% Trypsin/EDTA Life technologies 25200-056 with Phenol Red
2X Trypsin inhibitor Life technologies R-002-100
35mm tissue culture dish Corning Inc. 430165 Standard Tissue Culture Treated Surface
75cm2 tissue culture flask Corning Inc. 430641 Standard Tissue Culture Treated Surface
CCD camera Dage-MTI Model 300T-RC
Cell freezing container  Biocision BCS-045
EBM-2 Lonza Inc. CC-3156 HUVEC growth basal medium
EGM-2 Bulletkit Lonza Inc CC-4176 HUVEC growth factors for basal medium
FBS Life technologies 10082-147 Certified, Heat Inactivated
Gelatin Sigma G9391 from bovine skin
Hemacytometer Fisher scientific 02-671-51B 
Fibronectin Sigma F2006 from human plasma
Flow chamber Glyco Tech 31-001 Circular flow chamber for 35mm dishes
fMLP Sigma 47729
Histopaque-11191 Sigma 11191 Heavy ficoll
HUVEC Lonza Inc. CC-2517A
ICAM-1 R&D systems 720-IC Fc chimera
Lymphocyte separation medium Mediatech Inc. 25072CV Light ficoll
Microscope Zeiss Axiovert 100
RPMI 1640 medium Life technologies 11875 with L-Glutamine and Phenol Red  
Protein A Sigma P6031 resuspend in PBS
P-Selectin R&D systems 137-PS Fc chimera
Syringe pump KD Scientific KDS270
TNF-a Life technologies PHC3015 Recombinant Human Protein
Trypan Blue Solution, 0.4% Life technologies 15250-061
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References

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Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. J. Vis. Exp. (89), e51410, doi:10.3791/51410 (2014).
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