Super-Resolution Imaging di vescicole neuronali Dense-core
Summary
Si descrive come implementare fotoattivati microscopia localizzazione (PALM) a base di studi di vescicole in fissi, neuroni in coltura. I componenti chiave del nostro protocollo includono etichettatura vescicole con chimere fotoconvertibile, la raccolta di immagini crude scarsamente campionate con un sistema di microscopia super-risoluzione, e l'elaborazione delle immagini crude per produrre un'immagine super-risoluzione.
Abstract
Rilevamento della fluorescenza fornisce le basi per molte tecniche di microscopia molto utilizzate e in rapido progresso impiegati in applicazioni biologiche e mediche moderne. Punti di forza della fluorescenza comprendono la sua sensibilità, la specificità e la compatibilità con l'imaging dal vivo. Purtroppo, forme convenzionali di microscopia a fluorescenza soffrono di una debolezza, risoluzione diffrazione limitata importante nel piano di imaging, che ostacola studi di strutture con dimensioni inferiori a ~ 250 nm. Recentemente, questa limitazione è stata superata con l'introduzione di super-risoluzione tecniche di microscopia a fluorescenza, come la microscopia localizzazione fotoattivati (PALM). A differenza dei suoi omologhi convenzionali, PALM grado di produrre immagini con una risoluzione laterale di decine di nanometri. È quindi ora possibile utilizzare fluorescenza, con la sua miriade di forza, per chiarire uno spettro di attributi precedentemente inaccessibili di struttura e organizzazione cellulare.
_content "> Purtroppo, PALM non è banale da implementare e strategie di successo, spesso, devono essere adattati al tipo di sistema in fase di studio. In questo articolo mostriamo come implementare studi PALMA monocolore di strutture vescicolari, in neuroni in coltura fissi. PALM è ideale per lo studio delle vescicole, che hanno dimensioni che in genere vanno da ~ 50-250 nm. passaggi chiave nel nostro approccio includere etichettatura neuroni con fotoconvertibile (verde a rosso) chimere di vescicole carico, la raccolta di immagini RAW scarsamente campionate con sistema di microscopia super-risoluzione, e l'elaborazione delle immagini raw per produrre un'immagine PALM ad alta risoluzione. Abbiamo anche dimostrare l'efficacia del nostro approccio con la presentazione di immagini eccezionalmente ben risolte, di vescicole dense-core (DCVS) in neuroni ippocampali in coltura, che confutare l'ipotesi che il traffico extrasinaptica di DCVs è mediato principalmente dai cluster DCV.Introduction
Un certo numero di processi cellulari dipendono traffico accurato ed efficiente vescicola-mediata di biomolecole a destinazioni specifiche subcellulari. Un esempio importante è l'Assemblea sinaptica, che è preceduto da lunga distanza, consegna vescicola-mediata dei componenti sinaptiche da siti di biogenesi nel soma neuronale potenzialmente distali siti pre-e post-sinaptici 1.
Microscopia a fluorescenza è un metodo potente e popolare di studiare il traffico di vescicole. Punti di forza di questa tecnica sono la sua sensibilità, la specificità e la compatibilità con l'imaging dal vivo 2. Purtroppo, fino a tempi relativamente recenti, la tecnica ha subito da una grande debolezza, risoluzione di diffrazione limitata 2, che ostacola gli studi di strutture con dimensioni inferiori a ~ 250 nm. Recentemente, risoluzione laterale in microscopia a fluorescenza superato la barriera di diffrazione con l'introduzione di mi fluorescenza super-risoluzionetecniche croscopy, come PALM 3. La risoluzione laterale di PALM, decine di nanometri, è ideale per lo studio delle vescicole, che hanno dimensioni che in genere vanno da ~ 50-250 nm 4. È quindi ora possibile utilizzare fluorescenza, con la sua miriade di forza, per chiarire uno spettro di attributi precedentemente inaccessibili di vescicole, compresi alcuni aspetti del loro traffico verso specifici siti subcellulari.
PALM non è banale da implementare e strategie di successo, spesso, devono essere adattati al tipo di sistema in fase di studio. Qui si descrive come implementare studi Palma di strutture vescicolari, e abbiamo dimostrato l'efficacia del nostro approccio per il caso di DCVs in neuroni dell'ippocampo. In particolare, usiamo PALM affrontare l'ipotesi che il traffico di DCVs alle sinapsi dei neuroni dell'ippocampo è mediato dai cluster DCV 5-8.
Traffico Cluster-mediata di vescicole di sinapsi nello sviluppo di neurons è una possibilità intrigante perché può facilitare una rapida stabilizzazione sinaptica e il montaggio 9,10. I fautori della tratta cluster di DCVs citano la grande dimensione apparente del puncta fluorescente extrasinaptica ospitare esogeno DCV carico come prove a sostegno di clustering 6. Tuttavia, questi puncta appaiono in immagini generate utilizzando tecniche di microscopia a fluorescenza diffrazione limitata, che non sono adatti a distinguere gli effetti di dimensioni derivanti dalla diffrazione da quelli derivanti da clustering.
Per risolvere questo problema, abbiamo raccolto convenzionale fluorescenza widefield e le immagini palmo di neuroni dell'ippocampo che esprimono chimere mirati a DCVs. L'analisi di queste immagini ha rivelato che il> 92% dei presunti cluster DCV extrasynaptic in immagini convenzionali sono risolti come 80 nm (individuale DCV-sized) 11 puncta in immagini PALM. Quindi, questi dati ampiamente invalidare l'ipotesi di clustering applicati agli DCVs nello sviluppo hippocaneuroni mpal.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALM e super-risoluzione relative tecniche di microscopia a fluorescenza hanno recentemente emerso come un prezioso complemento alle forme meglio consolidati di microscopia ottica e microscopia elettronica (EM) 22-24. Attributi positivi di PALM includono relativamente semplice preparazione del campione e minimale perturbazione del campione. In linea di principio, PALM anche può essere usato per studiare le cellule viventi. Probabilmente il principale attributo negativo di PALM è l'acquisizione di dati r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede 2 R15 GM061539-02 (a BAS), 2 R15 NS40425-03 (a JEL), MH 66179 (il Dr. Gary Banker dell'Oregon Health & Science University / OHSU), e P30 NS061800 (il dottor Sue Aicher di OHSU). Ringraziamo Barbara Smoody per l'ampio supporto con la cultura di neuroni dell'ippocampo, e Drs. Brian lunga e James Abney per una lettura critica di questo manoscritto.
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
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