הכנת עצבית שיתוף תרבויות עם Precision תא בודד
Summary
פרוטוקולים לעריכה אחת נוירון microfluidic ומיסוך מים לדפוסי פלזמה בשבב של ציפויים ביולוגי מתוארים. ניתן להכין שיתוף תרבויות מקושרות ביותר באמצעות תשומות תא מינימליות.
Abstract
התגלמויות microfluidic של חדר Campenot משכו עניין רב מהקהילה מדעי המוח. פלטפורמות שיתוף התרבות מחוברות אלה יכולים לשמש כדי לחקור מגוון של שאלות, המשתרע נוירוביולוגיה התפתחותית והתפקודית לזיהום והתפשטות מחלה. עם זאת, מערכות קונבנציונליות דורשות תשומות משמעותיות סלולריות (אלפים רבים לתא), מספיקות לחקר תאי שפע נמוכים, כגון nigra substantia העיקרי דופאמין, גרעיני ספירלה, ונוירונים melanogaster Drosophilia, ולא מעשיות לניסויי תפוקה גבוהה. התרבויות צפופות גם הם הסתבכו מאוד באופן מקומי, עם כמה צמחים (<10%) מקשרות שתי תרבויות. במאמר זה פרוטוקולי microfluidic ודפוסים פשוטים מתוארים בו לטפל באתגרים אלה: (i) נוירון יחיד microfluidic עריכת שיטה, וכן (ii) שיטת מיסוך מים לציפוי בחומר ביולוגי דפוסים פלזמה register נוירונים ולקדם תולדה בין תאים. שיתוף תרבויות עצביות מינימליסטי הוכנו עם קישוריות intercompartment (> 85%) ברמה גבוהה ויכולות לשמש לניסויי נוירוביולוגיה תפוקה גבוהה עם דיוק תא בודד.
Introduction
רקמה עצבית היא מורכבת ביותר; תערובת סלולרית הטרוגנית שמסודרת מרחבית בתוך שכבות ותאים מוגדרים ועם קישוריות פלסטיק באמצעות אנשי קשר סלולריים ובמיוחד באמצעות צמחי האקסון ודנדריט. טכניקות חדשות נדרשות להעניק חופש ניסיוני יותר כדי לקבל תובנות ומנגנונים לפענח מרכזיים למחלות, פיתוח, ותפקוד בריא יותר עמוקים. קאמרי Campenot 1,2 ו 3,4 התגלמויות microfabricated לאחרונה יכולים לשמש להכנת vivo לשעבר של שיתוף תרבויות עצביות ברשת עם היכולת להפריע באופן סלקטיבי אוכלוסיות גופניות השונות וגם בצמחים neurite שלהם. מכשירי microfluidic אלה למשל נעשו שימוש כדי ללמוד ניוון האקסון והתחדשות הבא axotomy הכימי 5,6 או לייזר 6-8, tauopathy 9, הפצה ויראלית 10,11, ולוקליזציה mRNA באקסונים 4.
אף אוזן גרון ">כדי להרחיב את הטווח של neurobiologists, התפתחויות טכנולוגיות נדרשות להכין שיתוף תרבויות עצביות מינימליסטי. זה מאפשר התרת סבך של הרשת העצבית לחקירה של המערכת עם תא בודד ודיוק משנה הסלולר. הדרישה למספרים סלולריים מינימאליים פותחת את האפשרות לנתח את סוגי תאים נדירים, כוללים תאי nigra substantia דופאמין רלוונטיים למחלת הפרקינסון, גרעיני ספירלה מהאוזן, תאי עצב היקפיים, ותאי גזע. מעבר לכך, כלכלה סלולרית היא רלוונטית ליוזמה 3Rs. שימוש בפלטפורמות אלה microfluidic, מסכי רעילות בקנה מידה גדולה או תפוקה גבוהה אחרת, יכולה כעת להיחשב סדרה ניסיונית נתונים עשירים הדורשת נוירונים בבעלי חיים.
במאמר זה בפרוטוקולים לייצור ושימוש במכשיר microfluidic מתוארים. עריכת microfluidic בשילוב עם בbiomateri האתר שיטת הדפוסים אל יכול לשמש לרישום של שיתוף תרבויות עצביות ביניהם ביותר באמצעות מספרי תא מינימאליים. עריכת microfluidic מבוססת על זרימת ההפרש גישת 12-15, לפיה מלכודות microstructured ממוקמות בתוך מעגלים נוזליים (מאויר יחד עם תמונות SEM באיור 1). הנתיב 0 → 1 יש התנגדות נמוכה יותר fluidic (R 2> R 1) להובלת נוירונים למערך ליניארי של פתחי microstructured – פתחי הכניסה לערוצי תולדת neurite. תפוסה של המלכודת על ידי תא בודד באופן מקומי מעכבת את הזרימה להסיט המייעלים ללכידת תאים עוקבים במלכודות שכנות. התפוסה מלאה של המלכודות במערך מתגי יחס fluidic (R 1> R 2) להסיט המייעלת לתוך הנתיב מתפתל (0 → 2) כדי לייצר מצב עוקף של ניתוח לסילוק של תאי עצב עודפים.
<p class = "jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד">
איור 1. Microfluidic מעגל. א) מעגל התנגדות ההפרש fluidic לעריכת נוירון בודד עם איגוף תאי תרבות מחוברים על ידי ערוצי תולדה neurite. B, תמונות C) SEM של מערך שיתוף תרבות bilayer נוירון הממודר עם micropillars המניסקוס מצמיד. עם העיצוב הזה, מבני השמנה נוירון בצורת קלשון שימשו כדי לקדם fasciculation של צמחי neurite. איור ואגדה לשכפל באישור של החברה המלכותית לכימיה (RSC) 12. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
הכנת רשתות נוירונים micropatterned על מצעים מישוריים בקלות יכולה להיות מושגת (לexampl es מהקבוצה שלנו, רואה Frimat et al. 16 והיקה et al. 17). עם זאת, המתמצת דפוסי חומרים ביו בתוך מכשירי PDMS ועם הדרישה של יישור מיקרומטר בקנה מידה של אלה לערוצי microfluidic מציב אתגר טכני גדול. בסעיף 3.1 פרוטוקול, או באתרם, הכנה של דפוסים ביולוגי מוצג בשבב. דפוסים אלה מאפשרים רישום נוירון בלוחות זמנים ארוכים ולקדם את התרבות בצמחים בין תאים. microstructures המניסקוס-מצמיד משמשים כדי ליישר את מסכת מים מה שנקרא עם נוירון עריכת אתרים וערוצי תולדת neurite. מסכת המים מגנה על ציפוי מולקולת ההידבקות במהלך טיפול בפלזמה, בעוד שמשטחים חשופים הם התפרקו להגדיר את התבנית ביולוגי. בנוסף, פרוטוקולים ניתנים לתרבית תאים ולבידוד fluidic הכרחי לטיפול סלקטיבי של תאי שיתוף התרבות השונים.
ve_content "> הפרוטוקולים נועדו למנף את העקרונות ידידותיים למשתמש של ליתוגרפיה הרכה לשכפול של פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) מכשירי microfluidic 18. בדומה לכך, בדפוסים ביולוגי באתר הוא פשוט, תוך ניצול תופעות מתח אידוי ולפני שטח, ורק דורש מקור כף יד זול פלזמה. מעגל microfluidic ביעילות טיפולי טעינה סלולרי תוכניות ותא ספציפיים עושים פעולות אלה פשוט עניין של מחלק חומרים ליציאה התחתונה הנכונה ונשיפה מלמעלה. באופן זה, הוא נועד לתת neurobiologists החופש כדי להכין ולהשתמש במכשירי microfluidic במעבדות שלהם.Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקת עריכת microfluidic היא הראשון מסוגו, המאפשר טיפול בתא עצב יחיד דיוק להקמת תרבויות מינימליסטי. יחד עם בשיטת דפוסים ביולוגי באתרו, בגישה רבת עוצמה כדי ליישר דפוסי תא עם מבני microfluidic, יש תרבויות מינימליסטי אלה רמות קישוריות גבוהה intercompartment עם הסתבכות מקומית מו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לאולריך Marggraf (ISAS) עבור SU-8 ייצור ומריה בקר (ISAS) להדמית SEM. המחקר נתמך כלכלית על ידי (DFG WE3737/3-1), Bundesministerium für מענק Bildung und Forschung (BMBF 0101-31P6541) ועל ידי המיניסטריום החדשנות, Wissenschaft und Forschung des נדס Nordrhein-Westfalen. הודות היקה Hardelauf בית הספר למוסמכי לייבניץ הבינלאומי "מעבדה על שבב מערכות ביולוגיה" לתמיכה כספית.
Materials
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
| Coverslips | VWR | 630-1590 | 130-160 mm thick |
| 3 mm Biopsy Punches | Kai Medical | Handle with care – extremely sharp | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | S-50-HL | 1.65 mm ID; 3.35 mm OD |
| 1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix) | Braun | 6064204 | |
| 4-Way Tubing Connector | VWR or Fisher Scientific | ||
| Flow Regulator | Harvard Apparatus | 722645 | |
| 0.5 mm Pins | Dressmaking Departments | ||
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Stability in storage can be an issue |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| poly-lysine-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Inverted Fluorescent Microscope | |||
| Example Aspiration Pump | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
| Hand Held Corona Discharge Device | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | May not comply with your country's safety standards |
| Femto Plasma Oven | Diener Electronic | ||
| Vacuum Dessicator or Centrifuge |
References
- Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).
- Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93 (1), 1-12 (1982).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 559-565 (2005).
- Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
- Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84 (15), 6444-6453 (2012).
- Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons. Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
- Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10 (16), 2083-2092 (2010).
- Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108 (9), 2241-2245 (2011).
- Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3 (6), (2008).
- Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85 (13), 6220-6233 (2011).
- Dinh, N. D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13 (7), 1402-1412 (2013).
- Tan, W. H., Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4), 1146-1151 (2007).
- Frimat, J. -. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (14), 4925-4930 (2006).
- Frimat, J. P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
- Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11 (16), 2763-2771 (2011).
- Whitesides, G. M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Frimat, J. P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning. Anal. Bioanal. Chem. 395 (3), 601-609 (2009).
- Huang, N. P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
- Li, N., Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311 (2), 307-316 (2005).
- Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304 (5673), 987-990 (2004).
- Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, (2010).
- Brenneman, K. A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3), 238-248 (2000).
- Magalães, A. C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).
- Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).
- Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).
