Juxtasomal biocitina Etichettatura per studiare la struttura-funzione relazioni dei singoli neuroni corticali
Summary
Per comprendere la struttura delle reti neuronali, caratterizzazione funzionale e morfologica dei singoli neuroni è una necessità. Qui, dimostriamo etichettatura juxtasomal biocitina, che permette registrazioni elettrofisiologiche nella configurazione extracellulare, pur mantenendo la capacità di etichettare intracellulare neurone per la ricostruzione post-hoc di dendritiche e dell'architettura assonale.
Abstract
La corteccia cerebrale è caratterizzata da molteplici strati e molti tipi di cellule distinte che insieme come rete sono responsabili per molte funzioni cognitive superiori, tra cui il processo decisionale, il comportamento sensoriale-guidata o memoria. Per comprendere come tali reti neuronali intricate eseguire operazioni, un passo fondamentale è quello di determinare la funzione (o attività elettrica) di tipi di cellule individuali all'interno della rete, preferibilmente quando l'animale sta eseguendo un compito cognitivo rilevante. Inoltre, è altrettanto importante determinare la struttura anatomica della rete e l'architettura morfologica dei singoli neuroni per consentire reverse engineering rete corticale. Innovazioni tecniche oggi disponibili consentono di registrare l'attività cellulare in sveglio, comportandosi animali con la possibilità preziosa di post hoc identificare i neuroni registrati. Qui, dimostriamo la tecnica di etichettatura juxtasomal biocitina, che coinvolge l'azione di registrazione potenziometroal chiodare nella configurazione extracellulare (o loose-patch) con pipette di patch convenzionali. La configurazione di registrazione juxtasomal è relativamente stabile e applicabile a tutte le condizioni comportamentali, tra cui anestetizzato, sedato, sveglio testa fissa, e anche in animali liberi di muoversi. Pertanto, questo metodo consente il collegamento cellulare-tipo di azione specifico potenziale chiodare nel comportamento animale alla ricostruzione dei singoli neuroni e, in definitiva, l'intera microcircuito corticale. In questo video manoscritto, mostriamo come singoli neuroni nella configurazione juxtasomal possono essere etichettati con biocitina nel ratto uretano-anestetizzato per l'identificazione post hoc e la ricostruzione morfologica.
Introduction
Reti neuronali consistono di tipi cellulari diversi, caratterizzati da altamente specifiche proprietà morfologiche e fisiologiche 1-7. Di conseguenza, tipi di cellule individuali eseguono compiti specializzati all'interno della rete (si veda ad esempio Gentet et al. 8 e Burgalossi et al. 9). Stiamo solo cominciando a capire le funzioni di tipo specifico di cellule attraverso le reti neuronali e molto è ancora da scoprire. A tal fine, molti laboratori stanno attuando approcci sperimentali che consentono l'analisi delle proprietà morfologiche della stessa popolazione neuronale da cui sono stati ottenuti i parametri fisiologici 1,10-15. Qui, dimostriamo l'etichettatura tecnica juxtasomal 16,17 che comporta registrazioni elettrofisiologiche utilizzando pipette di patch convenzionali nella configurazione extracellulare (quindi non invasiva) in combinazione con elettroporazione del neurone registrato con biocitina. Ilgrande vantaggio di questo approccio è che la natura non invasiva assicura che l'azione potenziale spiking dei singoli neuroni viene registrato senza alterarne (es. dialisi) il contenuto intracellulare della cellula. Seguito da elettroporazione, l'approccio juxtasomal offre la possibilità di identificazione del post hoc delle cellule e la ricostruzione di collegare la funzione (fisiologia) alla struttura (morfologia). In genere, la ricostruzione morfologica prevede la ricostruzione della morfologia dendritica e assonale che può essere estesa a quantificazione di colonna vertebrale e / o bouton densità o anche la ricostruzione della morfologia neuronale a risoluzione nanometrica usando la microscopia elettronica. La tecnica di registrazione juxtasomal può essere utilizzata per le registrazioni in vivo di vari tipi di cellule attraverso strati corticali o in aree sub-corticali in una vasta gamma di specie, anche se la maggior parte degli studi hanno applicato la tecnica a piccoli roditori come topi o ratti. La nostra ricerca è focalizzata sulla registrazione e l'etichettatura dei neuronidi ratto corteccia somatosensoriale primaria (S1) e coinvolge l'identificazione visiva dei neuroni registrati 18, ricostruzioni dendritiche in combinazione con la registrazione precisa in un sistema di riferimento standardizzato per decodificare le reti corticali 4,19 e la ricostruzione dettagliata di architettura assonale per caratterizzare locale specifico tipo di cellule e lungo raggio proiezione obiettivi 20.
Rispetto al vivo di tecniche alternative di registrazione (intracellulari o cellule intere), le registrazioni juxtasomal sono relativamente stabili e possono quindi essere applicate attraverso gli stati comportamentali tra cui anestetizzato 21,22, sedati 14, sveglio testa fissa 23, o anche liberamente in movimento animali 9 . Qui vi mostriamo etichettatura juxtasomal in S1 di un ratto uretano-anestetizzato, anche se sottolineiamo l'applicabilità generale di questa tecnica per molte preparazioni di scelta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo juxtasomal permette la registrazione in azione vivo potenziale chiodare da singole unità le varie patologie comportamentali (anestetizzati, sveglio testa fissa o muoversi liberamente) con l'opzione di-biocitina etichettatura del neurone registrato per la post hoc tipo di cellula di classificazione e / o ricostruzione 3D. Il principale vantaggio è quello di ottenere parametri fisiologici nella configurazione extracellulare (quindi non invasiva), essendo ancora in grado di etiche…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare i Proff. Huibert Mansvelder e Bert Sakmann per il supporto esteso, il dottor Marcel Oberlaender per le discussioni fruttuose e di fornire tracciamento neuronale, e Brendan Lodder per l'assistenza tecnica. Dati è stata acquisita utilizzando il ntrode VI per LabView, generosamente offerto da R. Bruno (Columbia Univ., NY, USA). Questa ricerca è stata sostenuta dalla Max Planck Society e il Centro Bernstein for Computational Neuroscience, Tuebingen (finanziato dal ministero federale tedesco dell'Istruzione e della ricerca (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Centro per Neurogenomics e Cognitive Research (CNCR) , Neuroscienze Campus Amsterdam (NCA), finanziamenti per CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 e ENC-Network # p3-c3) e la VU University Amsterdam.
Materials
| SM-6 control system | Luigs & Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| Labview | National Instruments, Austin, TX, USA | ||
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA | ||
| (Labview acq. software) | |||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
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