Gebruik van een caspase Multiplexing Test van apoptose bepalen in een Hypothalamus Cell Model

Diëten rijk aan verzadigde vetzuren zoals palmitinezuur (PA) zijn verbonden met obesitas en andere comorbiditeiten, waaronder cardiovasculaire ziekte en diabetes ^{1, 2.} Vetrijke diëten hebben ook aangetoond dat oxidatieve stress, apoptose en neuronale degeneratie in de hypothalamus, een belangrijke regulator van de eetlust en het energieverbruik verhogen ^3-7. Inzicht in het mechanisme waardoor blootstelling vetrijke dieet induceert hypothalamus ontregeling is dus belangrijk voor de ontwikkeling van farmacologische behandelingen voor zwaarlijvigheid. Echter, de cellulaire mechanismen waardoor vet in de voeding van invloed op neuronale functie blijven onduidelijk. Een beter begrip van hoe vetten zoals PA begin van de hypothalamus apoptoseroutes zou kunnen leiden is een noodzakelijke eerste stap in de richting van dit doel. Het doel van dit artikel is om een multiplex assay voor in vitro testen van neuronale respons op PA belichting, ontwikkeld voor gebruik in studies van h beschrijvenypothalamic neurodegeneratie. Wij geven een gedetailleerde beschrijving van een in vitro 96-well formaat multiplex assay voor het meten caspase 3/7 activiteit per totaal aantal cellen in een gedifferentieerde geïmmortaliseerde volwassen muis hypothalamus cellijn (aangeduid A12) na challenge met oxidatieve PA ^8.

In het kort wordt levensvatbaarheid van de cellen bepaald volgens PA uitdaging via een resazurin gebaseerde test. Resazurin is een cel permeabele stof die enzymatische reductie van metabool actieve cellen ondergaat, een werkwijze verondersteld op te treden via de mitochondriën ^9. Levensvatbare cellen continu omzetten Resazurin te resorufine, produceren een fluorescent signaal evenredig met het aantal levensvatbare cellen. Caspase-3/7 Activiteit vervolgens geanalyseerd met een DEVD-gebaseerde lumogenic assay. DEVD is een aminozuursequentie (Asp-Glu-Val-Asp) gesplitst door caspase-3. Wanneer deze sequentie is gekoppeld met een lumogenic stof, na activatie van intracellulaire caspase-3/7 en daaropvolgende splitsingvan DEVD substraat, wordt het lichtgevende product uitgebracht. Deze reactie is evenredig met caspase activiteit en daarmee de inductie van apoptose. Dode cellen niet kan produceren caspase, caspase-3/7 activiteit is van nature van voorbijgaande aard; Daarom analyse moet verrichten tussen 30 minuten tot 4 uur na challenge, afhankelijk van de effectiviteit van de cel stressor. Cellevensvatbaarheid is omgekeerd evenredig met caspase-3/7 activiteit en kunnen worden gebruikt om mechanismen van celdood bepalen. Zo heeft deze methode eerder gebruikt dat voorbehandeling met het peptide hormoon orexin vermindert apoptose in hypothalamus cellen geprikkeld met waterstofperoxide, wat suggereert dat de mechanismen die door deze behandeling zijn belangrijk in het beschermen tegen oxidatieve beschadiging ¹⁰ te tonen. Het is belangrijk op te merken deze tests zijn cellijn-en weefsel-afhankelijke, als ze vertrouwen op mitochondriale activiteit assay reagentia verlagen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor volwassen muis hypothalamus (A12) cellen; echter,beschreven werkwijzen kunnen worden gewijzigd om te passen onder soortgelijk onderzoek.

Multiplexing testen van een kweekputje biedt een voordeel boven de traditionele methode om afzonderlijke tests om verschillende redenen. Naast het besparen van tijd, celsteekproeven en cultuur reagentia, kan multiplexing assays ook kennis van de overleving van de cel en de dood, bieden interne controles, en elimineren de noodzaak voor herhaalde experimenten ^{11, 12.}

Alternatieve werkwijzen ingeroepen Western blots of ELISA's, waarvoor betrouwbare tests zijn, maar zijn duur en tijdrovend (1-2 dagen), vooral bij gebruik van een 96-putjes. Exclusief de tijd die het kost om de cultuur cellen voor de multiplexing-assay, de totale tijd is minder dan 3 uur. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met A12 cellen kunnen worden aangepast voor gebruik in andere modellen maar vergeet factoren die cel integriteit kunnen beïnvloeden. Afschrikkenmijnbouw of dit protocol zou werken voor een reeks experimenten afhankelijk van het aantal monsters en proefomstandigheden en geplande downstream experimenten.