La encapsulación de la transcripción en células libres y las máquinas de traducción en vesículas para la Construcción de Imitadores celulares

1. Preparación de la plantilla de ADN Purificar plásmido a partir de una cepa de laboratorio estándar de E. coli, tales como E. coli DH5a o Nova azul con un kit comercial. Alternativamente, un producto de la PCR lineal se puede purificar de manera similar con un kit comercial. Eluir el ADN con H 2 O solamente. Fenol-cloroformo extracto de la solución de ADN 26. Determinar la concentración de ADN y la pureza, por ejemplo, mediante la absorbancia UV u otros métodos adecuados. Es importante la utilización de ADN altamente puro para una eficiente transcripción-traducción. 2. Preparación de la película delgada de lípidos Pesar el polvo de lípido seca y se disuelve en el disolvente. Para 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), soluciones madre se prepararon en cloroformo a una concentración de 40 mg / ml. Nota: Disolventes orgánicos siempre deben manipularse con pipetas de vidrio y botellas. En otras palabras, nunca debe ser utilizado plástico. S Storesoluciones tac, en botellas de aire ajustados resistente a los disolventes de vidrio ámbar a -20 ° C, preferiblemente en atmósfera de argón. Alícuota de 12 mol POPC (220 l de 40 mg / ml de solución madre) en un matraz de fondo redondo de 5 ml. Se evapora el disolvente con un evaporador rotatorio (Figura 1) para generar la película delgada de lípido. Fije firmemente el matraz de fondo redondo al tubo de destilación con un clip circular y comenzar la rotación del matraz. Iniciar la circulación de agua a través del serpentín del condensador. El uso de un baño de calor no es necesario, porque cloroformo tiene un bajo punto de ebullición de 61,2 ° C a la presión atmosférica normal. Asegúrese de que el sistema está abierto a la atmósfera por la comprobación de que la llave de paso está abierta. Encienda la bomba de vacío y cierre lentamente la llave de paso para aplicar el vacío al sistema. Una película delgada de lípido se deposita sobre las paredes del matraz de fondo redondo durante la evaporación rotatorio formando una película opacaque es visible por el ojo. Deje que la evaporación rotatoria continuará por 0.5-2 horas. Para detener el proceso, suelte lentamente la presión de vacío, detener la rotación, y retire el matraz de fondo redondo. 3. La resuspensión de lípidos y homogeneización Vesícula Añadir 1 ml 18.2 mW H 2 O a la película lipídica delgada directamente en el matraz de fondo redondo. Vórtice vigorosamente la solución a la velocidad máxima, aproximadamente 3.200 rpm, hasta que la película lipídica se separa de la copa, que es observable por el ojo. Transferir la dispersión de lípidos en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Puesta en marcha de un anillo de soporte para mantener un homogeneizador con una punta de 5 mm. Coloque un soporte debajo de la microcentrífuga homogeneizador para sostener con seguridad la dispersión de lípidos. Enjuague el elemento de dispersión del homogeneizador sumergiendo la punta de 18,2 mW H 2 O y en funcionamiento durante unos segundos. Coloque el elemento de dispersión directamente en la dispersión de lípidos asegurar ªen la punta no toque el fondo del tubo de microcentrífuga. Mezclar durante 1 minuto a potencia 4 ó 14.000 rpm. 4. Extrusión de vesículas y liofilización Montar las partes de la mini-extrusora (Figura 2), que consta de una carcasa exterior y una tuerca de retención que alberga dos membrana interna de teflón apoya, dos juntas tóricas, y un cojinete de teflón. Coloque las dos juntas tóricas en las ranuras de los soportes de membrana internas. Prehumedecido dos filtros y una membrana de 400 nm. Los filtros se colocarán en contra del Teflon interior de las juntas tóricas con la membrana entre ellos. Coloca la membrana apoya en la carcasa exterior extrusora con la membrana rodeada por dos filtros entre en las juntas tóricas. Coloque el cojinete de teflón interior de la carcasa y coloque la tuerca de retención y apriete a mano. Enjuague dos jeringas y llenar uno con 18,2 mW agua. Inserte las agujas de las jeringas en el pequeño holes en el teflón en cada extremo del conjunto de extrusor. Las agujas deben deslizarse con facilidad, no fuerce las agujas. Asegure la extrusora con las jeringas en la carcasa del extrusor y asegurar. Pasar el agua a través de la extrusora empujando lentamente el agua de una jeringa y en el otro. Esto representa un pasaje. Repita el procedimiento para un total de tres pasos necesarios para garantizar que no hay fugas presentes. Retire la jeringa de agua y deseche el agua. Llene una jeringa con la muestra, adjuntar a la extrusora, y pasar lentamente la solución de la vesícula a través de la membrana como se describe anteriormente en el paso 4.3. Repita 10 veces para un total de 11 pasajes. A medida que avanza el proceso de extrusión, la muestra se convertirá en menos turbia y más fácil de empujar a través de la membrana. Una disminución repentina en la resistencia, sin embargo, por lo general indica una ruptura de la membrana. Transferir la solución vesícula extruido y hacer 40 alícuotas de las vesículas en tubos de microcentrífuga.Congelación cada alícuota en cualquier hielo seco o nitrógeno líquido. Liofilizar cada alícuota con un evaporador centrífugo durante la noche a 30 ° C. Guarde las vesículas vacías liofilizadas a -20 ° C. 5. Encapsulación de transcripción-traducción Machinery Mezclar los componentes de la reacción de transcripción-traducción y añadir 20 unidades de inhibidor de RNasa. Incubar en hielo. Añadir la plantilla de ADN. Para una reacción de control, 250 ng de un plásmido de codificación mVenus o una proteína fluorescente similares detrás de un promotor transcripcional T7 y una fuerte E. Se recomienda sitio de unión a ribosoma coli. Llevar el volumen final a 25 l de agua libre de RNasa. Hidratar una alícuota de vesículas liofilizadas (del paso 4.6) con 10 l de la reacción montado en el paso 5.3. Vortex brevemente la mezcla hasta que se vuelven a suspender las vesículas. Esto debería tomar menos de 30 segundos. Incubar la reacción en hielo durante 30 min para permitir que las vesículas se hinchen. Diluir la mezcla de vesículas 20 veces hasta un volumen final de 30 l mediante la adición de 1,5 l de vesículas en 27,0 l de 50 mM de Tris-HCl, 50 mM de NaCl, pH 7,4 y 1,5 l de 20,2 mg / ml de proteinasa K. DNasa y RNasa también se puede añadir en este punto como una alternativa a la proteinasa K para degradar material de extravesicular. Incubar durante al menos 2,5 horas a 37 ° C. 6. Microscopía Examine las vesículas y el progreso de la producción de proteínas fluorescentes en diferentes puntos de tiempo. Las vesículas tendrán un diámetro mayor que los 400 nm de tamaño de poro de la membrana utilizada para la extrusión de las vesículas. Preparar una cámara de muestra, colocando una x 5 mm espaciador 20 de silicio sobre un portaobjetos de microscopio estándar. Pipetear 10 l de vesículas en la cámara de muestra. Coloque una hoja de cubierta de vidrio siliconado sobre la cámara. Tenga en cuenta las vesículas con un aceite de dispersión 63X or objetivo similar de campo claro y microscopía de fluorescencia utilizando el conjunto de filtro apropiado para la proteína fluorescente explotados.