De inkapseling van de Cell-free transcriptie en vertaling Machines in Blaasjes voor de bouw van Cellular Mimics

1. Voorbereiden van de DNA Template Zuiver plasmide uit een standaard laboratorium stam van E. coli, zoals E. coli DH5a of Nova Blue met een commerciële kit. Als alternatief kan een lineaire PCR product eveneens worden gezuiverd met een commerciële kit. Elueer het DNA met slechts H2O. Fenol-chloroform extract van de DNA-oplossing 26. Bepaal de DNA concentratie en zuiverheid, bijvoorbeeld door UV absorptie of andere geschikte werkwijzen. Het is belangrijk om zeer zuiver DNA gebruikt voor een efficiënte transcriptie-translatie. 2. Voorbereiden van de Thin Film Lipid Weeg de droge lipide-poeder en los op in oplosmiddel. Voor 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC) worden voorraadoplossingen bereid in chloroform bij een concentratie van 40 mg / ml. Opmerking: Organisch oplosmiddel moet altijd worden behandeld met glazen pipetten en flessen. Met andere woorden, moet plastic nooit gebruikt worden. Store stock oplossingen in luchtdichte, oplosmiddelbestendige amberkleurige glazen flessen bij -20 ° C, bij voorkeur onder argon. Aliquot 12 umol POPC (220 gl 40 mg / ml voorraadoplossing) in een 5 ml rondbodemkolf. Damp het oplosmiddel met een roterende verdamper (figuur 1) om de dunne lipide film genereren. Breng het rondbodemkolf hechten aan de destillatie buis met een cirkelvormige clip en start de rotatie van de kolf. Inleiding van de circulatie van water door de condensor. Met behulp van een warmte bad is niet nodig, want chloroform een ​​lage kookpunt van 61,2 ° C bij normale atmosferische druk. Ervoor zorgen dat het systeem is open voor de atmosfeer door te controleren of de kraan open is. Zet de vacuümpomp en langzaam sluit de plugkraan om het vacuüm in het systeem vast. Een dunne lipide film wordt afgezet op de wanden van de rondbodemkolf gedurende rotatieverdamping die een ondoorzichtige filmdat zichtbaar is met het blote oog. Laat de rotatieverdamping voortgezet 0,5-2 uur. Om het proces te stoppen, langzaam los van de vacuümdruk, stop de rotatie, en verwijder de rondbodemkolf. 3. Lipid Resuspensie en Vesicle Homogenisering Voeg 1 ml 18,2 MQ H2O de dunne lipide film direct in de rondbodemkolf. Krachtig vortex de oplossing bij maximale snelheid, ongeveer 3200 tpm, totdat de lipide film los van het glas, die waarneembaar zijn oog. Breng de lipide dispersie in een 2 ml microcentrifugebuis. Set-up van een ring staan ​​om een ​​homogenisator houden met een 5 mm tip. Plaats een microcentrifuge stand onder de homogenisator om veilig de lipidedispersie. Spoel het dispergeren element van de homogenisator door onderdompeling van de tip in 18,2 MQ H2O en actief gedurende enkele seconden. Plaats het verspreiden element rechtstreeks in de lipidedispersie zorgen thaan het uiteinde is de bodem van de microcentrifugebuis niet aan. Meng gedurende 1 minuut bij vermogensniveau 4 of 14.000 rpm. 4. Vesicle Extrusie en Lyofilisatie Monteer de onderdelen van de mini-extruder (figuur 2), die bestaat uit een buitenste behuizing en een borgmoer die twee Teflon interne membraan ondersteunt twee O-ringen, en een Teflon lager herbergt. Plaats de twee O-ringen in de groeven van de interne membraan steunen. Prewet twee filters en een 400 nm membraan. De filters tegen teflon worden geplaatst in de O-ringen met de membraan daartussen. Plaats het membraan ondersteunt in de extruder behuizing met membraan omringd door twee filters tussen de O-ringen. Plaats de Teflon lager in de behuizing en bevestig de borgmoer en draai deze met de hand. Spoel twee spuiten en vul een met 18,2 MQ water. Breng de spuit naalden in de kleine holes in de Teflon aan beide zijden van de extruder samenstel. De naalden moeten gemakkelijk ingaat, forceer de naalden. Beveilig de extruder met de spuiten in de extruder behuizing en zet vast. Passeren het water door de extruder door langzaam te duwen het water uit een spuit in de andere. Dit vertegenwoordigt een passage. Herhaal dit voor een totaal van drie passages ervoor te zorgen dat er geen lekken zijn aanwezig. Verwijder de spuit met water en gooi het water. Vul een spuit met het monster, hechten aan de extruder, en langzaam langs de vesicle oplossing door het membraan zoals hierboven beschreven in stap 4.3. 10x herhalen voor een totaal van 11 passages. Aangezien het extrusieproces opbrengst, zal het monster minder troebel en gemakkelijker te duwen over het membraan worden. Een plotselinge daling van de weerstand, echter, geeft meestal een scheuring van het membraan. Breng de geëxtrudeerde blaasje oplossing en maken 40 pi fracties van de blaasjes in microcentrifugebuizen.Flits bevriezen elke hoeveelheid wordt in droogijs of in vloeibare stikstof. Lyophilize elk aliquot met een centrifugale verdamper overnacht bij 30 ° C. Bewaar de gevriesdroogde lege blaasjes bij -20 ° C. 5. Inkapselen transcriptie-vertaling Machinery Meng de bestanddelen van de transcriptie-translatiereactie en voeg 20 eenheden RNase-remmer. Incubeer op ijs. Voeg de DNA-template. Een controlereactie, 250 ng een plasmide coderend mVenus of een soortgelijk fluorescerend eiwit achter een T7 transcriptionele promoter en een sterke E. coli ribosoom bindingsplaats wordt aanbevolen. Breng het uiteindelijke volume op 25 ul met RNase-vrij water. Hydraat een hoeveelheid gevriesdroogd vesicles (uit stap 4.6) met 10 ul van het reactiemengsel verzameld in stap 5.3. Kort vortex het mengsel totdat de vesicles worden geresuspendeerd. Dit moet in minder dan 30 sec. Incubeer het reactiemengsel op ijs gedurende 30 min om de vesicles te zwellen. Verdun het blaasje mengsel 20-voudig tot een eindvolume van 30 ul door toevoegen van 1,5 ul vesicles in 27,0 gl 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4 en 1,5 pi van 20,2 mg / ml Proteïnase K. DNase en RNase ook op dit punt worden toegevoegd als alternatief voor proteinase K extravesicular materiaal degraderen. Incubeer gedurende ten minste 2,5 uur bij 37 ° C. 6. Microscopie Onderzoekt de blaasjes en de voortgang van fluorescerend eiwit productie op verschillende tijdstippen. De blaasjes hebben een grotere diameter dan de 400 nm poriegrootte van het membraan voor vesicle extrusie. Bereid een monsterkamer door het plaatsen van een 20 x 5 mm silicium spacer op een standaard microscoop dia. Pipetteer 10 ul van vesicles in de monsterkamer. Plaats een gesiliconiseerde glazen deksel slip op de kamer. Let op de blaasjes met een 63X olie-dispersie or soortgelijke doelstelling van helder veld en fluorescentie microscopie met de juiste filter set voor de uitgebuite fluorescerend eiwit.