JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen Kindlin-3 uit Insect Cellen voor Biofysische Studies

Published: March 19, 2014
doi:
10.3791/51206
,
1Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics,University of Oxford

Summary

Kindlins fundamenteel celadhesie door integrines maar studies ervan werden gehinderd door de moeilijkheid erin recombinante expressie in bacteriële gastheren. We beschrijven hier werkwijzen voor de efficiënte productie in baculovirus-geïnfecteerde insectencellen.

Abstract

Kindlins essentieel coactivatoren met talin van het celoppervlak receptoren integrinen ook deelnemen aan integrine buiten in signalering en controle van gentranscriptie in de celkern. De kindlins zijn ~ 75 kDa multidomein eiwitten en binden aan een NPxY motief en upstream T / S cluster van de integrine β-subunit cytoplasmastaart. De hematopoietically allerbelangrijkste kindlin isovorm, kindlin-3, is van cruciaal belang voor de aggregatie van bloedplaatjes bij thrombusvorming, leukocyten rollen in reactie op infecties en ontstekingen en osteoclasten podocyte formatie in botresorptie. Rol Kindlin-3 in deze processen heeft geresulteerd in een uitgebreide cellulaire en fysiologische studies. Er is echter behoefte aan een efficiënte werkwijze van het verwerven van hoge kwaliteit milligram hoeveelheden van het eiwit voor verdere studies. Wij hebben een protocol ontwikkeld, hier beschreven voor de efficiënte expressie en zuivering van recombinant murine kindlin-3 door gebruik van een baculovirus-dverscheurd expressiesysteem in Sf9-cellen waarbij voldoende hoeveelheden zeer zuiver eiwit met volledige lengte zijn biofysische karakterisering mogelijk. Dezelfde benadering is mogelijk in de studie van andere zoogdieren kindlin isovormen.

Introduction

Eiwitten van de kindlin familie zijn een cruciaal onderdeel van focale adhesie assemblage, en dus essentieel voor complexe levensvormen. Kindlins, waarvan er 3 isovormen bij zoogdieren (kindlin-1, kindlin-2 en kindlin-3), beschouwd coactivatoren van de extracellulaire receptoren integrinen naast talin 1. Integrine gemedieerde celadhesie verbindt het celoppervlak aan de extracellulaire matrix (ECM) in hogere eukaryoten. Het is een kritische en gemeenschappelijk proces in een overvloed van fysiologische verschijnselen die weefsel integriteit, embryogenese, botmetabolisme, hemostase en immuniteit omvatten. Integrine-gemedieerde cel adhesie wordt geactiveerd via inside-out signaaltransductie via de binding van talin en kindlin de integrine β-subunit cytoplasmatische staart (CT) bij hun geconserveerde NPxY motieven. De biomedisch belang van kindlin eiwitten strekt echter tot aan de kern, waar kindlin-2 is aangetoond in verscheidene recente verslagen worden betrokken bij transcriptieal. controleren 2,3.

Kindlins zijn multidomein eiwit van ongeveer 75 kDa, gemerkt door het bezit van een tweedelige C-terminale FERM (4.1 band, Ezrin, radixin, Moesin) domein, dat wordt onderbroken door een pleckstrine homologie (PH) domein in het midden van de F2 subdomein 4,5. Studies van de kindlin-2 en kindlin-3 PH domeinen aangetoond dat het bindt aan de lipide second messengers fosfatidylinositol-(3,4,5)-trifosfaat en fosfatidylinositol-(4,5)-bisfosfaat 6-8. Echter, studies van de kindlin-1 PH domein blijkt dat het bindt aan Ptdlns (3,4,5) P3 met een veel lagere affiniteit, die kindlin-1 kan worden verklaard door een isoform-specifieke zoutbrug voorkomen lipiden binden 9. Daarnaast is er een ~ 100 aminozuur lus ingebracht in de F1 domein van de kindlins die voorspeld worden uitgevouwen maar bindt aan fosfatidylserine in de binnenste leaflet van de plasmamembraan 10,11. De kindlin FERMdomein wordt beschouwd homoloog is met de talin FERM domein, hoewel de talin FERM domein geen pleckstrin homologie domein bezitten. Zowel kindlins en talin interactie met NPxY motieven op de integrine β-staarten via de F3 regio hun FERM domein, maar kindlin bindt aan het membraan distale motief, terwijl talin richt zich op de membraan proximale een 12-16. Kindlins en talin zowel bovendien beschikken over een N-terminale domein F0 met een ubiquitine-achtige factor die niet wordt gevonden in andere FERM eiwitten 11,17. Studies over de F0 domein van kindlin-2 hebben aangetoond dat het onafhankelijk bindt aan fosfatidylinositol-(4,5)-bisfosfaat verrijkte membranen 17.

De kindlins vertonen paraloog-specifiek weefsel expressie patronen en niet-redundante fysiologische functies. Kindlin-1 wordt hoofdzakelijk uitgedrukt in de epidermis, maar in mindere mate de dikke darm, maag en nieren kindlin-2 alomtegenwoordig uitgedrukt, maar is geconcentreerd in gestreepte gladspier en is het enige kindlin uitgedrukt in embryonale ontwikkeling 4, en kindlin-3 wordt uitgedrukt in de hematopoietische weefsels met de hoogste concentratie van kindlin-3 in megakaryocyten 18. Echter, meer recente studies gesuggereerd dat functioneel eiwit wordt uitgedrukt in endotheliale weefsels en 19.

Kindlin-3 is van acute medisch belang vanwege de belangrijke fysiologische rol in het bloed. Het is van cruciaal belang voor de aggregatie van bloedplaatjes en verspreiden tijdens trombusvorming 20, leukocyten rollen in reactie op infecties en ontstekingen 21,22 en osteoclasten podocyte formatie in botresorptie 23. Bovendien, uitputting van kindlin-3 bij de mens leidt tot leukocytadhesie deficiëntie type III – een ziekte die wordt gekenmerkt door levensbedreigende bloeden stoornissen en terugkerende bacteriële infecties 20,24,25. Kindlin-3 knock-out studies bij muizen lieten de cruciale functie van het eiwit incel adhesie KIND3 -. / – muizen tonen verschillende fenotypes, zoals ernstige bloeden als gevolg van inactieve bloedplaatjes integrines, ernstige osteopetrosis, en verminderde leukocytenadhesie 20,22, lijkt op de symptomen bij de mens ontbreekt kindlin-3.

Structurele gegevens met een hoge resolutie op de kindlins, tot op heden, is beperkt tot individuele subdomeinen zoals de pleckstrine homologie (PH) domein van kindlin-1 9 en kindlin-2 26,27 en de F0 domein van kindlin-1 11 en kindlin -2 17. De meeste subdomeinen van elke kindlin polypeptide hebben echter tegengegaan klonering en structuuranalyse (Yates en Gilbert, ongepubliceerde waarnemingen), en studies van de volledige lengte eiwitten zijn gehinderd door de moeilijkheid expressie en zuiveren voldoende hoeveelheden met E. coli (ongepubliceerde observaties en Harburger et al.. 14). Er is een grote medische belangstelling kindlin-3 en de functies, samen met de twee andere familieleden, en recent bekomen we milligram hoeveelheden door recombinante expressie in Spodopterafrugiperda cellen gedreven door baculovirus infectie 12. Daarom hier beschreven werkwijzen voor de productie van milligram hoeveelheden recombinant muis kindlin-3 in insecten celkweek, voor uitgebreide structurele studies en biochemische analyse.

In dit protocol maken we gebruik van een aangelegde knockout bacmide (BAC10 KO: 1629) dat is, alleen, niet levensvatbare virions 28 produceren. Het virale DNA wordt dus gered door recombinatie met een transfer vector die in dit geval ook de kindlin-3 gen (FERMT3) en resulteert in de FERMT3 gen vervangt het virus zeer laat gen, die sterk tot expressie maar overbodig, waardoor een recombinant virus die muis kindlin-3 tot expressie als deel van de viruslevenscyclus 28. Wij deze geïdentificeerdWerkwijze voor de productie van kindlin-3 na pogingen te drukken en te zuiveren in andere expressiegastheren bleek bijzonder ingewikkeld (ongepubliceerde waarnemingen), maar ook door de veelzijdigheid van de Popin vector suite, die we gebruikten voor het kloneren en die geïmplementeerd in vele expressie hosts 29.

Protocol

Dit protocol veronderstelt dat de muis kindlin-3 gen (FERMT3) met succes gekloneerd in een vector stroomafwaarts van de zeer late p10 promotor en de vector bezit flankerende baculovirus sequenties recombinatie mogelijk de bacmide BAC10 KO: 1629 ontwikkeld door IM Jones en collega 28. Voor dit protocol, werd de kindlin-3-gen gekloond in pOPINE 29 en de primers en kloneringsstrategie gebruikt kan worden gevonden elders 12 beschreven. Het plasmide is ontworpen zodat de FERMT3 gen (kindlin-3) is onder controle van de p10 baculovirus promoter en de vector bevat 5 'UTR/ORF603 en ORF 1629 en codeert voor een C-terminale His 6-label voor stroomafwaartse zuivering 29. 1. Insect Cel Cultuur en Onderhoud Vóór recombinant baculovirus amplificatie Spodoptera frugiperda cellen aangepast aan suspensiekweek (Sf9-cellen) tegekweekt en gehandhaafd. Insectencellen moet altijd worden behandeld met behulp van aseptische technieken in een speciale weefselkweek zuurkast. Suspensiekweken van insectencellen geïncubeerd in Sf-900 II (SFM) serumvrij vloeibaar medium aangevuld met 100 ug / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine in kolven bij 27 ° C onder schudden bij 100 rpm. Handhaaf het insect celkweek dichtheid tussen 1 x 06-01 oktober x 10 7 cellen / ml door het splitsen en verdunnen van de celkweek met verse Sf-900 II media. Opmerking: gezonde cellen moeten uniform kijken in grootte en bolvormig moet zijn. Tel de cellen in een monstervolume behulp van een hemocytometer en lichtmicroscopie de cultuur celdichtheid berekend. 2. Generatie van recombinant Baculovirus Cultuur en handhaven Sf9 cellen in suspensie met Sf-900 II medium aangevuld met 100 ug / ml penicillin en 100 ug / ml streptomycine. Voor baculovirus generatie moet insectencellen worden gekweekt tot een dichtheid bereik van 5 x 05-1 oktober x 10 6 cellen / ml. Zaad ongeveer 1 x 10 6 Sf9-cellen per putje van een steriele 6-well weefselkweek plaat in 2 ml Sf-900 II medium aangevuld met 100 ug / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Laat de Sf9-cellen bij kamertemperatuur in de zuurkast te houden aan de onderkant van de kunststof putjes en vormen een monolaag. Voer recombinant baculovirus generatie door cotransfectie bacmide DNA en plasmide-DNA op monolaagkweek. Voor elke transfectie, meng 1-2 ug gezuiverd pOPINE-mFERMT3, die ORF1629 baculovirus elementen, met 0,5 ug gezuiverd BAC10 KO bezit: 1629 100 pl Sf-900 II SFM zonder antibiotica (oplossing A). In een aparte buis, verdunnen 6 pi Cellfectin II reagens met 100 ul van Sf-900 II SFM zonder antibiotica voor elke transfectie reactie (oplossing B). Een 'master mix' kan hier worden gemaakt, voor minder liquid handling, als er veel transfecties nodig. Meng de twee oplossingen (A en B, ongeveer 200 pl) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min aan een lipide-DNA-complex. Verdun de lipide-DNA complexen met 800 pl Sf-900 II SFM zonder antibiotica. Zuig voorzichtig de Sf9 celmonolaag media en voorzichtig pipet de oplossing A / B en de media op de top van de Sf9 monolaag. Incubeer de getransfecteerde cellen in een bevochtigde incubator bij 27 ° CO / N en voeg nogmaals 1 ml Sf-900 II SFM zonder antibiotica elk monolaagkweek de volgende dag. Incubeer cellen bij 27 ° C nog eens 5 dagen. Oogst de recombinante baculovirus direct uit het kweekmedium (ongeveer 2 ml in totaal) en overbrengen in een schone centrifugebuis (bijvoorbeeld een 15 ml Falcon buis). Verduidelijken welke Sf9 cel Debrwordt door centrifugatie bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng het virus, die in het resulterende supernatant en aangeduid P1, een schone buis en bewaar bij 4 ° C in het donker tot gebruik. In dit stadium de resterende Sf9 monolaag kunnen worden gebruikt om recombinante virusproductie evalueren door het bepalen van de aanwezigheid van recombinant kindlin-3 in insectencellen. Resuspendeer de monolaag met 0,5 ml PBS en verdun een 10 ul monster met gelijke volumes 2x SDS-PAGE laadbuffer. Verwarm de monsters bij> 95 ° C gedurende ten minste 10 minuten. Ultrasone trillingen het monster gedurende 1 sec bij 10% amplitude behulp van een micro-sonicator tip als het te stroperig voor een goede gel laden. 3. Amplificatie van recombinant Baculovirus Voor de amplificatie van virus in suspensie, gebruikt een celdichtheid van 1,4 x 10 6 cellen / ml en dit zou bezetten 1/20 van het totale volume kolf (bijvoorbeeld 50 ml cultuureen 2 L kolf). Het bereiken van de amplificatie van het recombinant virus door het infecteren van de insecten celkweek met P1 virale voorraad bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,1 met de volgende formule; Opmerking: P1 virusproductie kan worden aangenomen dat een verwachte virale titer van 1 x 10 7 pfu / ml hebben. Toch kan een plaque assay worden uitgevoerd vóór deze fase. Incubeer de P1-geïnfecteerde insectencellen kweek bij 27 ° C onder schudden bij 100 rpm gedurende 3 dagen (72 uur). Oogst de virus door het scheiden van de cellen van het medium door centrifugatie bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Bewaar de verkregen celpellet in dit stadium bevestiging van recombinante virusproductie door beoordeling kindlin-3-eiwit expressie door SDS-PAGE en western blotting. Breng de geklaarde-virus verrijkte media een schone buis en bewaar bij 4 ° C inhet donker tot gebruik. Deze virale voorraad wordt aangeduid als P2. Opmerking: Een virale titer van 2 x 10 8 pfu / ml (of een versterking van 100 pve / cel) kan worden verwacht. 4. Expressie van kindlin-3 in Baculovirus-geïnfecteerde Sf9 Kweek een voldoende hoeveelheid Sf9-cellen kweken in suspensie in Sf-900 II SFM aangevuld met 100 ug / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, voor grootschalige recombinante kindlin-3 expressie voor zuivering. Incubeer de suspensie kweken bij 27 ° C onder schudden bij 100 rpm en met een totale kweekvolume: fles volumeverhouding van 01:05. Infect suspensiekweken van Sf9 bij een dichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml. Supplement Sf9 kweken met een eindconcentratie van 1% (v / v) foetaal runderserum (FBS) gevolgd door versterkte recombinant virus (P2-virale stock) een MOI van 1 geven. Incubeer de geïnfecteerde kweken bij 27 ° C onder schudden bij 100 rpm. Oogst recombinatient kindlin-3-CHIS 6-expressie Sf9-cellen 72 uur na infectie door centrifugeren bij 1000 xg   en de resulterende celpellet opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik, of -80 ° C voor lange termijn opslag. 5. Zuivering van recombinant Kindlin-3 Dooi bevroren-baculovirus geïnfecteerde insecten cel (Sf9) pellets die recombinant kindlin-3 op het ijs. Resuspendeer de ontdooide celpellet met lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1% (v / v) Tween-20), aangevuld met EDTA-vrije proteaseremmer cocktail en 1000-2000 U van DNase1. Opmerking: Als alternatief kan gemodificeerd fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) ook worden gebruikt, wanneer de NaCl-concentratie aangepast tot 500 mM niet-specifieke interacties tussen endogene Sf9 cellen eiwitten en de geïmmobiliseerde metaal affiniteitskolom voor stroomafwaartse zuivering (zie hieronder) te voorkomen. Lyseren de cellen door incubatie van de geresuspendeerde cellen met het wasmiddel en vortexing. Ultrasone trillingen (40% amplitude, 10 cycli van 10 seconden puls gevolgd door 10 seconden afkoeling) het monster voor verdere celdisruptie in een ijsbad of als alternatief een Dounce homogenisator. Verduidelijken het lysaat door centrifugatie bij 48.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C. Laad het resulterende supernatant op een HisTrap kolom (5 ml kolomvolume), vooraf geëquilibreerd met lysisbuffer, bij 4 ° C met een snelheid van 1 ml / min. Opmerking: Als alternatief kan het geklaarde lysaat worden geïncubeerd met 1-5 ml bedvolume vooraf geëquilibreerd nikkel sepharose korrels (bijvoorbeeld Ni Sepharose 6 Fast Flow) bij 4 ° C gedurende 1-2 uur. Een kolom van Ni Sepharose kan worden gevormd na de bindingsstap door een kolom zwaartekracht. Was de kolom met 10 kolomvolumes wasbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazool) om ongebonden eiwitten te verwijderen. Gebruik een lineaire gradiënt imidazool 10-500 mM met een snelheid van 10 mM / ml (of 10 kolomvolumes) met een AKTA FPLC te eluerende gebonden recombinant kindlin-3-CHIS 6. Fractioneren de elutie in 0,5-1 ml fracties met de Akta FPLC met die fracties die kindlin-3-CHIS 6 gewoonlijk geëlueerd bij een imidazool concentratie van 300 mM. Beoordeel de eiwitsamenstelling van het elutiemiddel door SDS-PAGE en voor eerste zuiveringen bevestigd door Western blotting met anti-His6 antilichaam of anti-muis kindlin-3 antilichaam. Voeg de fracties die kindlin-3 en buffer uitwisseling in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl via een reeks verdunningen in buffer en monsterconcentraties met een centrifugale concentrator eiwit met een 50 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) bij 4 ° C. Opmerking: Als alternatief dialyseer de eiwitoplossing met Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette met een MWCO van 30 kDa bij 4 ° C gedurende 4 uur tot O / N in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl. Opmerking: voor ionenwisseling (zie hieronder) een lagere concentratie van NaCl, <em> ie 50 mm, en is gebruikt voor deze stap. Breng de buffer uitgewisseld eiwitoplossing op een vooraf geëquilibreerd HiTrap heparine HP kolom (5 ml kolomvolume) met een AKTA FPLC met een snelheid van 0,5 ml / min. Opmerking: Het gebonden kindlin-3 wordt geëlueerd met een lineaire NaCl gradiënt (0,2 M NaCl tot 1 M NaCl) in dezelfde buffer verhogen met een snelheid van 10 mM / ml. Kindlin-3-CHIS6 verwacht wordt te elueren bij ongeveer 0,6 M NaCl. Fractioneren de elutie in 0,5-1 ml fracties en de eiwitsamenstelling door SDS-PAGE en western blotting beoordelen, indien van toepassing. Opmerking: men kan een eiwitzuiverheid van bijna 95% verwacht, zoals bepaald door SDS-PAGE. Pool fracties die kindlin-3 en concentraat met een centrifuge concentrator eiwit met een 50 kDa MWCO tot een uiteindelijk volume van 0,5-2 ml. In een laatste stap, polijst de geconcentreerde proteïneoplossing en bufferuitwisseling het eiwit met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). Breng het gezuiverde eiwit op een Superdex S200 (16/60) of (10/30) vooraf geëquilibreerd in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM DTT met een snelheid van 1 ml / min of 0,5 ml / min afhankelijk kolomgrootte gebruikt. Opmerking: Gelpermeatiechromatografie ook in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) worden uitgevoerd indien nodig. Zuiver de eiwitten op grootte door toepassing van buffer op de kolom met een snelheid van 1 ml / min of 0,5 ml / min, afhankelijk kolomgrootte gebruikt. Opmerking: Het eiwit geëlueerd uit de kolom gefractioneerd en gecontroleerd met behulp van de absorptie bij 280 nm. Een absorptiepiek worden verwacht van SEC, die gefractioneerd en beoordeeld door SDS-PAGE om homogeniteit te bepalen, en is typisch> 95% zuiver na deze stap. Concentreer het gezuiverde kindlin-3-CHIS 6 middels een centrifuge concentrator eiwit met een 50 kDa MWCO naar ~ 15 mg / ml, zoals spectrofotometrisch met een berekende extinctiecoëfficiënt (ε) van 109.320 M-1 cm -1 </ Sup> (ervan uitgaande dat alle cysteïne-residuen worden verkleind). Voor opslag bij -20 ° C en lange termijn opslag bij -80 ° C, de hoeveelheid eiwit in PCR buizen en flash-bevriezen de monsters in vloeibare stikstof. Als alternatief kan het eiwit direct worden gebruikt voor onderzoek met een aantal biochemische en biofysische technieken.

Representative Results

De grootschalige expressie van recombinant muizen kindlin-3 met baculovirus geïnfecteerde Sf9 cellen minder dan twee weken te milligram hoeveelheden bereiken, zoals geïllustreerd in het schematische figuur 1A en vereist slechts een kleine hoeveelheid plasmide DNA van een QIAprep Miniprep kit voor voorbeeld. Het genereren van recombinant baculovirus wordt verkregen door cotransfectie van Sf9 cellen met muis kindlin-3 (FERMT3) bevattende plasmide met een aangelegde gelineariseerd bacmide (BAC10: KO 1629) en oogsten van de nieuw gevormde virions na 5-7 dagen, zie figuur 1A. Deze methode van baculovirus generatie resulteert in 100% recombinante virussen en wezen verdeelt de noodzaak van plaquezuivering 28,30. Een representatieve kleinschalige (2 ml monolaag) cultuur dan ook een recombinant-virus bevattende oplossing met een verwachte virale titer van 1 x 10 7 plaque-vormende eenheden (PFU) per ml genererencultuur. Men kan een plaque assay het werkelijke virale titer te bepalen, maar dit is misschien te arbeidsintensief wanneer een groot aantal constructen getest voor structurele studies. Het succes van de virusproductie stap kan worden beoordeeld door toepassing van een eGFP-bevattend plasmide in parallel, of deze kindlin 3-construct kan het Sf9 monolaag worden geresuspendeerd in PBS en beoordeeld door SDS-PAGE en Western blotting, die typisch aantoont een duidelijke band die overeenkomt met een 75 kDa His-gelabeld eiwit, zoals weergegeven in figuur 1B. Virus vervolgens geamplificeerd voldoende hoeveelheden grootschalige (liter volumes) insectencel infectie recombinant eiwit isolation generate. De tweede doorgang virus (P2) wordt opgewekt door het infecteren suspensiekweken voor een MOI van 0,1 (zie protocol). Het is essentieel dat de versterking Sf9 suspensiecultuur neemt slechts een twintigste van de totale kolfvolume. Deze extra beluchting zodat de resulterende virus-bevattende media, geoogst na 3 dagen (72 uur) na infectie voldoende hoeveelheden kindlin-3 te genereren in de daaropvolgende expressie cultuur. De geamplificeerde virusvoorraad (P2) wordt aangenomen dat een verwachte virale titer van 2 x 10 8 pfu / ml gebaseerd op een conservatieve schatting van 100 pfu / cel met een celdichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml tijdens de amplificatie 31 bezitten. In het algemeen, voor optimale baculovirus amplificatie en eiwitproductie, de Sf9 cellen moet uniform zijn in grootte en sferische, zoals weergegeven in figuur 1C. Bovendien virale amplificatie en eiwitexpressie is maximaal bij 72 uur na infectie, en beide aanzienlijk gereduceerd bij 96 uur na infectie. Wanneer virus is geamplificeerd en gebruikt om Sf9-cellen te infecteren in grootschalige experimenten recombinant kindlin-3 wordt gedeeltelijk gezuiverd door zijn gemodificeerde C-terminale His 6-tag met geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie, zoals weergegeven in figuur 2. Het is belangrijk om de zuivering uit te voeren bij 4 ° C en voldoende proteaseremmers toegevoegd om proteolyse te voorkomen. De gedeeltelijk gezuiverde kindlin-3 wordt verder gezuiverd tot bijna homogeen door ionenuitwisselingschromatografie (IEC) met een heparine-kolom, zoals getoond in figuur 3. We gebruikten het gebruik van een heparine-kolom in plaats van een conventionele ionische uitwisselende kolom, zoals we voorspelden dat het grote aantal basische residuen, waaronder een poly-lysine rek in de kindlin-3 F1 domein, zou sterk interageren met de negatief geladen sulfaatgroepen van de kolom. Deze strategie is bijzonder nuttig voor DNA-en RNA-bindende eiwitten met basisch nucleïnezuur-bindende pleisters, bijvoorbeeld de RNA-bindende terminal uridylyltransferase Cid1 32. Tenslotte kindlin-3 zuiverheid "gepolijst" door size exclusion chromatografie om aggregaten te verwijderen en homogeniteit, zoals weergegeven inFiguur 4. De in de protocollen buffers standaard buffers veelvuldig bij eiwitzuivering voor structurele analyse. In het algemeen worden fosfaathoudende buffers vermeden voor het zuiveren van eiwitten voor structurele studies, vooral kristallisatie screening door de vorming van fosfaat kristallen in de kristallisatie druppels (met name voor experimenten bij 4 ° C). Echter, hebben we een Thermofluor gebaseerde thermische shift assay te bepalen welke buffers stabiliserende voor kindlin-3, zoals getoond in figuur 5. In het kort wordt een gezuiverde eiwitoplossing verdund in buffer die een bereik van pH en natriumchloride concentraties omvatten derhalve de vorming van een 2-dimensionaal scherm. Het smelten van het eiwit wordt gemeten door het observeren van de fluorescentie van Sypro oranje kleurstof (Molecular Probes), dat bindt aan hydrofobe resten in het gevouwen eiwit kern, het temperatuurbereik 20-95 ° C (293-368 K). De temperatuur midden-punt waarbij ee eiwit ontvouwt (transitie temperatuur, T m) werd berekend met de Opticon Monitor-software en wordt elders 33 beschreven. Kindlin-3 waargenomen stabiel bij hoge concentraties natriumchloride (500 mM) in het pH-traject 7,0-9,0, met een constante temperatuur (Tm) van 55 ° C. Er werd ook waargenomen dat de Tm van Kindlin-3 ongeveer 55 ° C binnen het pH-bereik 7,0-7,5 ongeacht natriumchloride concentratie. We vonden dat er beperkte proteolyse van kindlin-3 tijdens de zuivering, maar SDS-PAGE-analyse van sterk geconcentreerde eiwit (~ 15 mg / ml) vertoonde weinig verontreiniging met twee extra polypeptiden van gelijke intensiteit. Vreemd, maar er is geen indicatie van aanvullende soorten van gelpermeatiechromatografie, zoals weergegeven in figuur 4. Derhalve wordt gedacht dat het eiwit inkepingen door proteasen maar gevouwen blijft en hydrodynamically onderscheiden van eiwit van volledige lengte. Interessant Calpaïne is een protease dat bekend splitst kindlin-3 in Tyrosine373, die in de β1 β2-lus van het pleckstrine homologie (PH) domein 34 en kunnen onze waarnemingen verklaren. Bovendien western blotting blijkt dat een van de polypeptide doubletten bezit een C-terminale His-tag en het schijnbare molecuulgewicht van het doublet, wanneer opgeteld, evenaart 75 kDa, hetzelfde molecuulgewicht als het natieve eiwit. De opbrengst aan gezuiverd recombinant kindlin-3 per liter Sf9-cellen (~ 2 g celgewicht) is hooguit 5 mg. Figuur 1. Overzicht van baculovirus-geïnfecteerde insectencel heterologe eiwitexpressie. (A) een schematisch overzicht van baculovirus generation en expressie van kindlin-3 in Sf9 cellen. In de DNA-vector schema, wordt 5'UTR / ORF603 gekleurd in rood, de ORF1629 is gekleurd in groen en het gen van het eiwit van interesse (POI) is blauw gekleurd. (B) Western blot, gebruik van een anti-His 6 antilichaam, van zes kleinschalige (2 ml monolaag) culturen (lanen geëtiketteerd volgens de cultuur) van Sf9 cellen die recombinant baculovirus en recombinant muizen kindlin-3. (C) Lichtmicroscopie beeld van gezonde Sf9-cellen gekweekt in suspensie in Sf-900 II SFM aangevuld met antibiotica en overgebracht naar een 35 mm well weefselkweek schaal (zie protocol). Afbeelding is 20x vergroting. Figuur 2. VERTEGEntative zuivering van kindlin-3 door geïmmobiliseerde metaal affiniteitschromatografie (IMAC). SDS-PAGE nikkel affiniteit gezuiverd recombinant murine kindlin-3 expressie in met baculovirus geïnfecteerde Sf9-cellen (~ 2 g celgewicht). Geadsorbeerde eiwit werd geëlueerd met een gradiënt imidazool (boven de gel getoond). Lanen zijn als volgt gemerkt; MW, molecuulgewichtmerker, Lys, geheel cellysaat, FT, stromen door (ongebonden), WI, wassen 1, WII, wassen 2. Western blot analyse (onder) werd ook uitgevoerd met behulp van de elutiefracties om de aanwezigheid van de kunstmatige His-tag op het recombinante eiwit te bevestigen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3. Vertegenwoordiger zuivering van kindlin-3 door Heparine Affinity Chromatography. (A) Elutieprofiel waargenomen bij 280 nm (blauw) het weergeven van een enkele symmetrische piek eluting onder een lineaire natriumchloridegradiënt (groen) met behulp van de NaCl-concentratie bereik van 0,05-1,0 M. ( B) SDS-PAGE-analyse van de gefractioneerde elutie het aantonen van de aanwezigheid van de 75 kDa eiwit, kindlin-3 (gelabeld K3). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4. Representatieve gelfiltratiechromatografie en geconcentreerd kindlin-3. (A) Gel filtratie elutieprofiel gezuiverd kindlin-3 meteen Superdex S200 (16/60) in Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl en 1 mM DTT bij 20 ° C. Gebaseerd op het elutievolume, kindlin-3 migreert als verwacht voor een 75 kDa eiwit, wat suggereert dat het overwegend monomeer. (B) SDS-PAGE van hooggeconcentreerde gezuiverd recombinant kindlin-3 op 14.5 mg / ml. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 5. Thermofluor gebaseerde thermische Shift Assay Buffer voor screening. Kindlin-3 werd verdund in verschillende buffers omvattende een tweedimensionaal scherm pH versus natriumchloride concentratie. Overgangstemperatuur (temperatuur middens) waargenomen door fluorescentie van dehydrofoob gebonden kleurstof, Sypro oranje (Molecular Probes) en berekend met de Opticon Monitor software. (A) Een 3D histogram van de transitie temperaturen uitgezet samen met (B) een verandering overgangstemperatuur van het berekende gemiddelde van 50.4 ° ​​C. Voor de duidelijkheid de bars zijn gekleurd volgens het bereik van temperaturen waaraan zij corresponderen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Baculovirusexpressiesysteem systemen worden steeds populairder en een belangrijk instrument voor de productie van milligram hoeveelheden recombinant eiwit voor eiwit karakterisering door middel van biofysische studies, waaronder X-ray kristallografie. Ondanks het feit dat meer experimenteel eist de baculovirusexpressie systemen bieden een aantal voordelen ten opzichte van E. coli waarvan er een bijna-natieve omgeving voor proteïnen van eukaryote oorsprong zoals de aanwezigheid van geschikte chaperonnes en kansen voor post-translationele modificatie. In onze eigen inspanningen om kindlin-3 te drukken, werden alternatieve uitdrukking gastheren gebruikt, waaronder zoogdieren cellijnen en bacteriële expressie stammen (ongepubliceerde waarnemingen). Algemeen de vele E. coli-stammen getest geproduceerd zeer kleine hoeveelheden recombinant kindlin-3 (~ 0,5 mg / L van cultuur, ongepubliceerde waarnemingen). De baculovirus-gedreven expressie in insectencellen was bijzonder doeltreffend en in samenwerkingmparison om tijdelijke expressie in zoogdiercellen ontvankelijker voor het genereren van de grote benodigde biomassa voor het isoleren van een milligram recombinante cytoplasmatische eiwitten (ongepubliceerde waarnemingen). We speculeren dat de aanwezigheid eukaryote chaperonnes de efficiënte productie van kindlin-3 kunnen toestaan.

De baculoviridae infecteren insectencellen en voor recombinante eiwitexpressie het baculovirus gebruikt in dit werk is gebaseerd op het Autographa californica nucleaire polyhedrosisvirus (AcNPV). In de natuur is de AcNPV, die de Autographa californica (alfalfa takkenschaar) insectenlarven infecteert, vereist de polyhedrine eiwit aan afsluitingen waarbij de vironen zijn ingekapseld in een kristallijne eiwitmatrix aldus de nodige bescherming van hun vrijlating te vormen. In gekweekte cellen de vorming van occlusielichamen is niet vereist voor replicatie en derhalve overbodig. Bij expressie vreemde eiwitten kan de polyhedrine eiwit gen zijn replaced in een recombinant AcNPV met het gen voor het eiwit van belang. AcNPV kunnen andere lepidopteron diersoorten infecteren en voor de toepassing van recombinante eiwitexpressie army worm Spodoptera frugiperda popstadium ovariumcellen gebruikt. In de hier geschetste benadering, wordt de AcNPV bacmide (BAC10) zo gebouwd dat een essentieel viraal gen, ORF1629, wordt geïnactiveerd door toevoeging van chloramfenicol acetyl transferase resulteert in een knock-out bacmide (BAC10: KO 1629), zodat het niet infectieuze baculovirions 28 vormen. Cotransfectie van Sf9 cellen met gelineariseerd BAC10: KO 1629 en FERMT3-bevattende transfervector herstelt de inactieve ORF1629, door omzetting, wat resulteert in een levensvatbaar genoom die ook is opgenomen de FERMT3 gen onder de controle van de polyhedrine promoter 28.

We beschrijven een zuivering protocol voor de isolatie van zeer zuivere recombinant muis kindlin-3 via een three stap chromatografische aanpak. De hier gebruikte methode kan gemakkelijk worden toegepast op andere His-gemerkte eiwitten. We gebruikten een ionenuitwisseling stap kindlin-3 verder te zuiveren maar wij geloven dat dit een verdere pseudo-affiniteit stap als kindlin-3 bezit een groot aantal basische residuen, waaronder een poly-lysine rek binnen de F1 domein. Bovendien wordt kindlin-3 geacht te binden aan en interactie met de cytoplasmatische zijde van de plasmamembraan, waar het functioneert en derhalve voorspellen wij dat de clustering van basische resten zal het eiwit aan het negatief geladen membraan tegen te gaan.

De bij de zuivering protocollen beschreven buffers standaard beschouwd en worden vaak gebruikt in structurele biologie. De thermofluor assay (figuur 5) toont aan dat kindlin-3 stabiel meeste bufferomstandigheden boven pH 6,0. Dit was bijzonder nuttig en belangrijk voor het informeren van onze experimenten bij het bestuderen kinldin-3: β1Een staart interactie met NMR, die uitstekende spectra leverde bij een pH van 6,1 met lage concentraties van NaCl 12.

Voordat een biofysische onderzoek kan worden uitgevoerd, is het belangrijk aan te tonen dat het gezuiverde eiwit van belang inderdaad correct gevouwen en is functioneel actief. In een eerdere publicatie toonden we aan dat de recombinante kindlin-3 tot expressie gebracht en gezuiverd met behulp van deze methode een monomeer en monodispers in oplossing, zoals bepaald door grootte-uitsluitingschromatografie, dynamische lichtverstrooiing, analytische ultracentrifugatie en kleine hoek X-ray scattering en was ook in staat te binden en het herkennen van de membraan-distale NPxY en upstream Serine / Threonine cluster van β 1A cytoplasmatische staarten 14, hetgeen bevestigt dat het zich gedraagt ​​als het natieve eiwit, hetgeen in lijn is met eerdere cellulaire en fysiologische studies 14,20,22. Het gebruik van een thermische stabiliteit test is een extra manier suggereren ee juiste vouwing van een eiwit van belang, zoals verkeerd gevouwen eiwitten leidt tot een hoge fluorescentie due blootgestelde hydrofobe residuen.

De kindlin familie van eiwitten is de focus van veel aandacht sinds hun onverwachte rol als essentiële coactivatoren van integrines in vivo werd ontdekt. Dit heeft veel moeite om ze op recombinante uiten en op te lossen hun structuren geactiveerd. Tot op heden beperkt succes gemeld in expressie milligram hoeveelheden van volledige lengte recombinant eiwit maar we hebben beschreven het gebruik van een baculovirus systeem dat grootschalige expressie maakt in zodanige hoeveelheden dat structurele studies worden overgegaan. Door het genereren van grote hoeveelheden recombinant kindlin-3 verwachten we dat deze verdere studies van dit eiwit zal helpen. De baculovirus-gedreven weg en zuivering workflow beschreven voor recombinant muizen kindlin-3 kan ook worden gebruikt om de andere kindlin isovormen tot expressie en zuiveren, Die ook moeilijk uit te drukken en ook beschikken polylysine stukken en kan verder worden aangepast voor andere cytoplasmatische eiwitten, zoals nucleïnezuur-bindende eiwitten, die niet tot expressie in bacteriële stammen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Weixan Lu voor technische bijstand in de cultuur en het onderhoud van de Sf9 cel voorraden. LAY werd ondersteund door een Medical Research Council (MRC) afgestudeerde studententijd. RJCG was een Royal Society Universiteit Research Fellow. The Oxford afdeling Structurele Biologie is onderdeel van het Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Wellcome Trust Core Award Grant Number 090532/Z/09/Z.

Materials

Sf-900 II serum free media (SFM) 1X liquid Life Technoligies 10902-096 store at 4°C and warm to room temperature before use
Cellfectin II Reagent InVitrogen 10362-100 Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used
Streptomycin Sulphate (solid) Melford S0148 Sterilise filter (0.22μm filter) before use
Penicillin G, potassium salt (solid) Melford P0580 Sterilise filter (0.22μm filter) before use
CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate Greiner bio-one 657160
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10100-147
Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8849 Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO
Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I  Sigma D5025
HisTrap FF (5ml)  GE Heathcare 17-5286-01 Requires an Äkta FPLC machine
HiTrap Heparin (5ml) GE Heathcare 17-0407-01 Requires an Äkta FPLC machine
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane) Millipore UFC905024 15ml capacity and a MWCO of 50kDa protein concentrator
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moser, M., Legate, K. R., Zent, R., Fassler, R. The tail of integrins, talin, and kindlins. Science. 895, 899 (2009).
  2. Yu, Y., et al. Kindlin 2 forms a transcriptional complex with β-catenin and TCF4 to enhance Wnt signalling. EMBO Rep. 13, 750-758 (2012).
  3. Yu, Y., et al. Kindlin 2 promotes breast cancer invasion via epigenetic silencing of the microRNA200 gene family. Int J Cancer. , (2013).
  4. Meves, A., Stremmel, C., Gottschalk, K., Fassler, R. The Kindlin protein family: new members to the club of focal adhesion proteins. Trends Cell Biol. 19, 504-513 (2009).
  5. Siegel, D. H., et al. Loss of kindlin-1, a human homolog of the Caenorhabditis elegans actin-extracellular-matrix linker protein UNC-112, causes Kindler syndrome. Am. J. Hum. Genet. 73, 174-187 (2003).
  6. Hart, R., Stanley, P., Chakravarty, P., Hogg, N. The kindlin 3 PH domain has an essential role in integrin LFA-1-mediated B cell adhesion and migration. J. Biol. Chem. , (2013).
  7. Liu, J., et al. Structural basis of phosphoinositide binding to Kindlin-2 pleckstrin homology domain in regulating integrin activation. J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).
  8. Qu, H., et al. Kindlin-2 regulates podocyte adhesion and fibronectin matrix deposition through interactions with phosphoinositides and integrins. J. Cell Sci. 124, 879-891 (2011).
  9. Yates, L. A., et al. Structural and Functional Characterisation of the Kindlin-1 Pleckstrin Homology Domain. J. Biol. Chem. 287, 43246-43261 (2012).
  10. Bouaouina, M., et al. A conserved lipid-binding loop in the kindlin FERM F1 domain is required for kindlin-mediated αIIbβ3 integrin coactivation. J. Biol. Chem. 287, 6979-6990 (2012).
  11. Goult, B. T., et al. The structure of the N-terminus of kindlin-1: a domain important for AlphaIIbBeta3 integrin activation. J. Mol. Biol. 394, 944-956 (2009).
  12. Yates, L. A., Fuzery, A. K., Bonet, R., Campbell, I. D., Gilbert, R. J. Biophysical Analysis of Kindlin-3 Reveals an Elongated Conformation and Maps Integrin Binding to the Membrane-Distal β-Subunit NPXY motif. J. Biol. Chem. 287, 37715-37731 (2012).
  13. Anthis, N. J., Campbell, I. D. The tail of integrin activation. Trends Biochem. Sci. 36, 191-198 (2011).
  14. Harburger, D. S., Bouaouina, M., Calderwood, D. A. Kindlin-1 and -2 directly bind the C-terminal region of beta integrin cytoplasmic tails and exert integrin-specific activation effects. J. Biol. Chem. 284, 11485-11497 (2009).
  15. Tadokoro, S., et al. Talin binding to integrin beta tails: a final common step in integrin activation. Science. 302, 103-106 (2003).
  16. Garcia-Alvarez, , et al. Structural determinants of integrin recognition by talin. Mol. Cell. 11, 49-58 (2003).
  17. Perera, H. D., Ma, Y. Q., Yang, J., Hirbawi, J., Plow, E. F., Qin, J. Membrane binding of the N-terminal ubiquitin-like domain of kindlin-2 is crucial for its regulation of integrin activation. Structure. 19, 1664-1671 (2011).
  18. Ussar, S., Wang, H. V., Linder, S., Fassler, R., Moser, M. The Kindlins: subcellular localization and expression during murine development. Exp. Cell Res. 312, 3142-3151 (2006).
  19. Bialkowska, K., et al. The integrin co-activator Kindlin-3 is expressed and functional in a non-hematopoietic cell, the endothelial cell. J. Biol. Chem. 285, 18640-18649 (2010).
  20. Moser, M., Nieswandt, B., Ussar, S., Pozgajova, M., Fassler, R. Kindlin-3 is essential for integrin activation and platelet aggregation. Nat. Med. 14, 325-330 (2008).
  21. Lefort, C. T., et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119, 4275-4282 (2012).
  22. Moser, M., et al. Kindlin-3 is required for beta2 integrin-mediated leukocyte adhesion to endothelial cells. Nat. Med. 15, 300-305 (2009).
  23. Schmidt, S., Nakchbandi, I., Ruppert, R., Kawelke, N., Hess, M. W., Pfaller, K., Jurdic, P., Fassler, R., Moser, M. Kindlin-3-mediated signaling from multiple integrin classes is required for osteoclast-mediated bone resorption. J. Cell Biol. 192, 883-897 (2011).
  24. Malinin, N. L., et al. A point mutation in KINDLIN3 ablates activation of three integrin subfamilies in humans. Nat. Med. 15, 313-318 (2009).
  25. Svensson, L., et al. Leukocyte adhesion deficiency-III is caused by mutations in KINDLIN3 affecting integrin activation. Nat. Med. 15, 306-312 (2009).
  26. Liu, Y., Zhu, Y., Ye, S., Zhang, R. Crystal structure of kindlin-2 PH domain reveals a conformational transition for its membrane anchoring and regulation of integrin activation. Protein Cell. 3, 434-440 (2013).
  27. Liu, J., et al. Structural basis of phosphoinositide binding to kindlin-2 protein pleckstrin homology domain in regulating integrin activation. J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).
  28. Zhao, Y., Chapman, D. A., Jones, I. M. Improving baculovirus recombination. Nucleic Acids Res. 31, (2003).
  29. Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35, 45 (2007).
  30. Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J Struct. Biol. 172, 55-65 .
  31. Wasilko, D. J., et al. The titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65, 122-132 (2009).
  32. Yates, L. A., Fleurdépine, S., Rissland, O. S., De Colibus, L., Harlos, K., Norbury, C. J., Gilbert, R. J. Structural Basis for the activity of a cytoplasmic RNA terminal uridylyl transferase. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 782-787 (2012).
  33. Sainsbury, S., Ren, J., Saunders, N. J., Stuart, D. I., Owens, R. J. Crystallization and preliminary X-ray analysis of CrgA, a LysR-type transcriptional regulator from pathogenic Neisseria meningitidis MC58. Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 797-801 (2008).
  34. Zhao, Y., et al. Regulation of cell adhesion and migration by Kindlin-3 cleavage by calpain. J. Biol. Chem. 287, 40012-40020 .

Tags

Recombinant Murine Kindlin-3Insect CellsBaculovirusSf9 CellsProtein PurificationBiophysical StudiesIntegrinsCell SignalingPlatelet AggregationLeukocyte RollingOsteoclast Formation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J. Vis. Exp. (85), e51206, doi:10.3791/51206 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image