조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가
Summary
이 프로토콜은 FACS – 매개 세포 분리, 유체 역학적 유전자 전달하고, Peyer의 패치 면역 부분 집합의 흐름 분석과 관련된 기술을 사용하여, 일반적인 돌기 세포의 전구 세포에서 Peyer의 패치 plasmacytoid 수지상 세포의 분화를 평가하는 실험 절차에 대해 설명합니다.
Abstract
이 프로토콜은 장 Peyer의 패치 (PP)에 plasmacytoid 수지상 세포 (PDC)를 생성하는 정제 조혈 전구 세포의 기능을 분석하는 방법을 자세히 설명합니다. 공통 수상 세포 전구 세포 (CDP가 린 – C-KIT LO CD115 + FLT3 +)을 FACS로 C57BL6 마우스의 골수로부터 정제 및 PP에서 상당한 PDC 인구 부족받는 마우스에 옮겼다,이 경우 IFNAR – / – 마우스는 전송받는로서 사용 하였다. 일부 마우스에서, 수상 세포 성장 인자 FLT3 리간드 (Flt3L)의 과발현 Flt3L-인코딩 플라스미드의 유체 역학적 유전자 전달 (HGT)를 사용하여, CDP가 전송 입양 이전에 시행되었다. Flt3L 과발현이 전송 (또는 내인성) 조혈 전구 세포에서 발생하는 DC의 인구를 확장합니다. 전구 전송 후 7-10일에서, 적응 적 전송 조상에서 발생 올라가고은에받는 사람의 세포를 구별했다전송 CDP가가 + CD45.1되는 사람과받는 사람이 CD45.2의 + 인에서 올라가고있는 CD45 마커 표현의 기초. PP의 PDC 인구에 기여하고 Flt3L에 대응하는 전송 CDP가의 능력을받는 마우스의 PP 단일 세포 현탁액의 유동 세포 계측법에 의해 평가 하였다. 이 방법은 다른 전구 인구 PDCS PP를 생성 할 수 있는지 여부를 테스트하는 데 사용될 수있다. 또한,이 접근법은 HGT 통해 순환 사이토킨을 조작하여 추정 발달 요인 및 / 또는 적절한 넉다운 녹아웃 또는 과발현으로 원종 서브 세트를 전송함으로써, PP에서 PDC 발달에 영향을 미칠 것으로 예측되는 인자의 역할을 조사하기 위하여 사용될 수있다 . 이 방법은 PP의 PDC는이 보호 프로파일의 다른 면역 하위 집합의 주파수 또는 기능에 미치는 영향을 분석 할 수있다. / – – 마우스, 심각하게 고갈 PP 올라가고 야생 형 동물에 대해, 따라서 allowi을 보여이 방법의 독특한 기능은 IFNAR의 사용이다치명적인 조사에서 교란 효과의 부재에있는 PP 올라가고의 NG의 재구성.
Introduction
여기서 우리는 일반적인 돌기 세포 전구 세포 (CDP가이) Peyer의 패치 (PP)의 plasmacytoid 돌기 세포 (PDC) 인구에 상승을 줄 수 있는지 여부를 평가하기위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법의 전반적인 목표는 Peyer의 패치 (PP의 PDC)에 올라가고의 개발 규제를 평가하는 것이었다. 이 중요한 이유는 PP의 PDC의 골수, 혈액, 비장 등 다른 조직에서 발견 올라가고 다른, 따라서 그것이 PP의 올라가고 및 다른 PDC의 인구가 발달 및 / 또는 기능적으로 관련 있는지 불분명하다는 것이다. 구체적으로 올라가고 널리 I는 수신자 같은 수용체 7 빠른 IFN 분비 1-3 9 (TLR7 / 9) 자극에 반응, 조혈 시스템 내에서 (IFN) 생산 인터페론의 주요 유형으로 알려져있다. 그러나, PP의 올라가고 내가 TLR 길항제 자극 4,5에 대한 응답으로 IFN 유형을 생산 부족합니다. 또한, PP 올라가고는 골수와 비장에서 발견 PDC의 다른입력 신호를 필요로하는 난 (IFN) 수용체 (IFNAR1를) 인터페론 또는 IFN은 개발 및 / 또는 축적 5에 대한 분자 STAT1 신호. 이러한 데이터는 별개의 규제 메커니즘은 다른 장기에 올라가고 대 PP의 PDC는 (예를 들어, 골수, 비장) 5를 제어 가능성을 제안했습니다.
이 방법의 개발을 주도 이론적 근거는 수지상 세포 (DC) 생물학을 이해하는 최근의 진보에 근거했다. 대부분의 경우, 전부는 아니더라도, DC 부분 집합은 FMS 같은 티로신 키나제 수용체 3 (FLT3) 6-10 표현 조혈 전구 세포에서 파생되지만, DC 개발은 고전 골수성과 림프 경로에 제한되지 않습니다. 예를 들어, FLT3은 + 일반적인 골수 전구 세포 (CMP한다, 린 – IL-7R – 무서 1 – C-키트 + CD34 + FcγR LO / -) CDP가 (린 – C-키트 싸다 CD115 + FLT3 +) 일으키다, whic시간이 더 올라가고 기존의 DC (CDCS) 9,10로 분화. 대조적으로, FLT3 + 일반 림프 전구 세포 (CLP를, 린 – IL-7R + 무서-1 LO 형 c-Kit LO)은 올라가고 (11)에 주로 개발한다. 따라서, 종래의 연구는 일반적인 분석 골수, 비장 및 / 또는 혈액 PDC 서브 세트로 제한되어 있지만, PDCS는, Flt3L의 규제 하에서 적어도 두 별개의 조혈 전구 개체군에서 발생 나타낸다. 따라서, PP 올라가고을 생성하는 전구 인구 (들) 조사를 요구했다. PP 올라가고의 기원을 이해하는 것은 그들이 다른 PDC 집단과 일반적인 발달 경로를 공유하는지 여부에 있나, 또는 PP에서의 생성 중에 서로 다른 메커니즘을 활용합니다.
본원에 기재된 방법의 고유 한 이점은 조혈 전구 세포의 대체 입금받는 등 PP PDCS의 심한 결핍을 보여 생쥐의 사용이다. 유전자를 가진 쥐유전자 인코딩 TIC 삭제 IFNAR1 (IFNAR – / – 마우스) 또는 STAT1 (STAT1는 – / -) PP 올라가고 5 눈에 띄는 고갈을 공개했다. 따라서, 이들 균주를 대체 전송의 연구는 치명적인 조사 유력한 세포 절제 체제의 부재하에 수행 될 수 있도록, PP의 PDCS이 감소 된 환경을 제공한다. 여기에 제시된 방법의 추가 강도 Flt3L의 높은 순환 양을 자극하는 유체 역학적 유전자 전달 (HGT)의 사용이다. 이 재조합 단백질의 주입 대, 생체 내에서 Flt3L을 유도 할 수있는 비용 효과적인 방법을 제공합니다. 우리의 실험실을 포함하여 많은 연구, 실험 조건 5,12,13의 다양한 사이토 카인의 양을 유도 HGT를 사용했다.
DC의 노동 정확한 면역 기능의 분할은 면역학의 주요 관심입니다. 특히, PDC의 경구 관용과 조직의 항 바이러스의 중요한 매개체입니다반응은, 그러나 그들은 또한자가 면역과 암 14 ~ 17의 개발과 보존에 기여할 것으로 보인다. 여기에 설명 된 프로토콜은 PP 올라가고 조절 발달 메커니즘을 더욱 완벽하게 탐험 할 수 있습니다. 또,이 방법은 연구 PP PDC 함수를 평가할 수 있고, 프로파일 내의 다른 면역 인구의 규제와 기능을 이해하기 위해 확장 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
(- / – 마우스 예 IFNAR) 설명 입양 전송 기술은 여기에 PP 올라가고있는 불충분받는 생쥐의 PP PDC 인구에 CDP가의 기여를 평가했다. 미래의 실험에서는, PP의 PDCS는 FLT3 + CLP를 파생 여부 특히, PP의 PDCS 생성에 다른 전구 서브 세트들의 전위를 평가하는 것이 중요 할 것이다. 이 질문은 PP의 올라가고는 PP 적립 5를위한 IFNAR-STAT1 신호에 고유 민감한 이유는 불분명하게 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Drs에 감사드립니다. 유체 유전자 전달의 조언 알렉스 Gelbard와 빌렘 Overwijk. 이 작품은 NIH (AI098099, SSW), 암 후성 유전학의 MD 앤더슨 센터, 염증 및 암의 MD 앤더슨 센터 (SSW) 및 RE 바브 스미스 교육 기금 (HSL)에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10XHBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat ant-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
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