通过激光捕获微分路，从小鼠脊髓运动神经细胞体中生成RNA进行转录分析

这里描述的老鼠麻醉、安乐死和心脏灌注的程序是根据耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准的协议进行的。 1. 准备无 RNase 仪器和解决方案 RNase 是所有实验室表面的常见污染物，包括台面、微皮和调查器。 经常更换手套或定期用 RNAse 除毒溶液擦拭。 不锈钢解剖工具和玻璃器皿可在 1 小时或更> 200 °C 的加热下实现 RNase 免费。注意：蒸汽灭菌不会破坏 RNase。或者，用 RNase 除损溶液擦拭，然后用无 RNase 70% 乙醇和空气干燥。 用 RNase 除毒溶液擦拭台面、其他实验室表面和微尖端，然后用无 RNase 70% 乙醇擦拭。指定用于RNA恢复和分析的特定实验室工作台或工作区域。注意：在擦拭管道管的轴之前，先取下尖端弹出器，如果可能，请将其关闭。 使用经制造商认证的管子、微型中微管、移液器和微皮条尖，确保无 RNase。建议使用非常低的绑定提示和微管。如果可能，使用新打开的这些部件的盒子或袋子，并将其与一般实验室供应分开。 从商业来源获得无 RNase 解决方案 [杜尔贝科的无钙和无镁 PBS ）、乙醇、无 RNase 70% 乙醇] 。每个实验使用新打开的瓶子。 Azure B 染料的来源对于成功恢复完整的 RNA 至关重要。在将珍贵样品进行染色和收集之前，先测试每批染料。从非体验动物中收集几千个神经元，准备RNA，并确定下文所述的RNA完整性，以找到一个持续产生 RIN 数字高于 8.5 的神经元。 在无 RNase 70% 乙醇中溶解 Azure B 染料 （1%，wt/vol），通常在 50 毫升离心管中溶解 30 毫升乙醇中的 0.3 克。在 RT 的摇杆上混合一夜，或直到所有粒子溶解。此解决方案的一管可用于在不影响染色强度的情况下染色多个滑梯。 作为预防措施，使用不同的污渍管为每个生物复制。 使用冷冻金和O.C.T.嵌入脐带部分，无需进一步治疗。 将冷冻状态保持在 -20 至 -24 °C。 分割后，将幻灯片放在 -80 °C 冰柜中，直到准备了足够数量。幻灯片制作完后，尽快开始 RNA 准备。对于长期存储，请将未选中或部分分割的 OCT 块保持在 80 °C，而不是幻灯片。 使用RNA制备套件制造商提供的解决方案，利用解剖的运动神经元制作用于RNA制备的瓜尼丁硫氰酸酯缓冲器。 2. 从小鼠准备脊髓部分（图1A） 通过用 RNase 除损溶液烘烤或擦拭所有解剖工具、玻璃滑梯、剃须刀片和解剖平台，然后是无 RNase 70% 乙醇。让干燥2分钟。用实验室湿巾覆盖，使一切无尘。 动物处理程序，包括麻醉、心脏灌注和安乐死，应按照当地机构动物护理和使用委员会（IACUC）的要求进行，目的是迅速将动物带到脊髓解剖的地步。 麻醉小鼠通过内在（ip）注射致命剂量氯胺酮（450毫克/千克）。 一旦达到深度麻醉，并确认缺乏脚趾捏反应，将小鼠心室侧放在解剖平台上（例如发泡胶板），打开胸腔暴露心脏，并将输液的27G蝴蝶针插入左心室（位于调查员的右侧）。使用锋利的钳子将右中庭尼克，使用围产泵以 5-7 毫升/分钟的速度与 PBS 一起香水，时间约为 2 分钟。此时，从中庭流出的液体应该基本上没有血迹。 取出灌注针，斩首鼠标，并在解剖板上将其翻过来。打开皮肤露出脊柱，用小剪刀和钳子去除椎骨，抬起脊髓，同时用锋利的钳子切断神经根部。速度和实践对于从灌注开始到去除脐带至关重要：这应该不超过7分钟。 在无 RNase 水中冲洗脐带 10 秒，以洗去任何残留的血液。将脊髓放在无 RNase 的玻璃滑梯上，弯曲的钳子非常温和但快速。使用干净的剃须刀刀片将脊髓横向分割成 9-10 块。 将碎片放在一个充满O.C.T.的低温金中，使用相同的钳子，并用干净的针头垂直对齐它们。将模具放入含有2甲基丁烷的浅托盘中，用液氮预冷，然后将托盘放入液氮浴池中，快速冷冻脊髓片，避免RNA降解。 在分割前将 OCT 嵌入式块存储在 -80 °C 中长达 6 个月。从线的检索到冻结的过程应在 5 分钟内完成，以保持 RNA 完整性。 在-20°C的.C无鼻塞 PEN 膜 2μm 滑梯上，在 RNase 无 PEN 膜 2 μm 滑梯上，用低温统计器进行冷冻切除，产生 20 μm 切片，每个切片包含 9-10 个脊髓横截面，最初保持在室温下，以确保各部分粘附在幻灯片上。立即重新冻结冷冻器内 -20 °C 表面上的部分。将幻灯片保持在-80°C，直到使用。 3. 脊髓部分污渍（图1A） 在干净的架子上，安排六个50毫升的圆锥形管。将所有部分填充 25-30 毫升无 RNase 70% 乙醇，以便深度足以在幻灯片浸入时覆盖幻灯片上的所有部分。制作 30-35 毫升 1% Azure B 解决方案，并将其放在同一机架上，以尽量减少洗涤或染色过程中更换溶液之间的时间。将三到四个实验室湿巾放在机架前，以便快速排出额外的溶液。 将滑梯从-80°C冰柜中滑出到干冰上。将幻灯片放在戴手套的手掌上，解冻一张幻灯片。通过用实验室擦拭去滑梯上的大部分水分和凝结物，小心不要触摸部分。将滑梯放在培养皿中的新鲜硅凝胶干燥剂上30-40秒，完全干燥。如果实验室湿度高，可以在真空干燥器中进行简短的处理，以更快地干燥滑梯。 洗涤和染色。 将干滑梯浸入第一管无 RNase 70% 乙醇中。浸泡幻灯片30秒，然后洗滑梯，通过上下浸取45-60秒来去除OC。将滑梯从溶液中取出，将多余的液体排出实验室湿巾上。通过将幻灯片浸入第二管 70% 乙醇中，重复相同的过程。如果脊髓部分周围的 OCT 没有完全消失，则重复在第三根管中清洗。 排干多余的液体后，将滑梯浸入 70% 无 RNase 乙醇中的 1% Azure B 溶液中，浸入 30-45 秒。将多余的 Azure B 排出实验室擦拭：在这一点上，整个幻灯片将是蓝色的。 将滑梯浸入下一管70%乙醇中，快速上下浸3-4倍，以去除多余的染料，使特定的运动神经元染色可见。如果这些部分看起来非常暗，请重复70%乙醇的新鲜管中的脱污步骤。如果染色似乎太轻，将幻灯片返回到 Azure B 解决方案 30 秒，然后重复除污。擦去多余的乙醇，将滑梯晾干约40秒，直到所有的液体都消失。灰质为浅蓝色，而运动神经元将染成深蓝色，很容易看到。立即开始解剖。 4. 激光捕获微分（LMD）（图1B） 打开显微镜并卸载管架，将 0.6 毫升微胶管的盖子连接在一起，以便收集样品。将30μl瓜尼丁硫氰酸酯裂解缓冲器放入0.6毫升微胶管的盖中。使用移液器尖端传播溶液，用液体覆盖盖住盖子表面。这样，所有收集的神经元在解剖时都会溶解在溶解溶液中。将盖子与孔和目标与显微镜软件对齐。将盖在盖上的位置，直到开始激光捕获。 将空气干燥的滑梯倒置在 LMD 显微镜的舞台上，使 PEN 幻灯片的膜朝下。带部分的膜应面向孔，其下方是收集管。 在开始幻灯片准备前 10 分钟打开激光。专注于具有 5 倍目标的脊髓部分。移动到 20X 目标进行解剖。 用轻笔标记一个”虚拟”区域，并允许激光在不收集的情况下将其切出。这放松了 PEN 膜，并使得连续标记和切割多个区域成为可能。 重新聚焦并识别心室角区域中的运动神经元。这些神经元可以通过它们的位置、金字塔形态、大尺寸和深蓝色染色（图2）来识别。 使用轻笔，选择绘图工具，沿着运动神经元的边缘标记，制作一个完整的轮廓。尽量使轮廓接近运动神经元，以避免运动神经元以外的细胞污染。（事先测试某些部分，查看激光切线的宽程度，并根据需要调整间隙。切割前标记多个单元格：软件会记住的位置。 单击盖位，将盖在切割位置下方。单击启动按钮，用激光启动运动神经元解剖。从单个滑动的所有部分收集所有运动神经元，进入一个微管的盖子。 收集完成后，通过卸载托盘并轻轻拆下管子，将微管从支架中取出。通过上下管道将溶液完全溶解在缓冲器中的运动神经元。在 4 °C 下以 14，000 x g 的离心度将溶液移入管体 2 分钟。 立即将样品冷冻在干冰中，并将其储存在-80°C。 这个过程，从滑动染色通过运动神经元集合，应在30分钟内完成一个幻灯片，以尽量减少RNA退化。 5. 运动神经元的RNA制备 从一种动物中解冻所有收集的神经元，并将它们汇集在一起提取RNA。样品可能看起来淡蓝色，这取决于其中运动神经元的数量（沾染了Azure B）。根据为 LMD 组织提供的协议，使用合适的套件提取 RNA，以尽可能小的体积提取。服用1微克检查样品的数量和完整性。将剩余的RNA快速冷冻在干冰上，储存在-80°C。 6. 确定RNA质量和数量 根据制造商的协议，用毛细丝电泳微流体芯片上的 1 μl 样本确定 RNA 质量。RNA 完整性编号 （RIN） 高于 8.5 的总 RNA 制剂可用于 RNA-seq 和 qRT-PCR。数据输出通常还包括样品的大致浓度。