Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu
Summary
Bu videoda, farenin enine abdominis kasının diseksiyonu için bir protokol gösteriyoruz ve nöromüsküler kavşakları görselleştirmek için immünofluoresans ve mikroskopi kullanıyoruz.
Abstract
Nöromüsküler kavşak morfolojisinin analizi, belirli bir motor nöronun fizyolojik durumu hakkında önemli bilgiler verebilir. İnce düz kasların analizi, arka uzuvdan gelenler gibi geleneksel olarak kullanılan daha kalın kaslara göre önemli bir avantaj sağlayabilir(örn. gastrocnemius). İnce kaslar, belirli bir kas için tüm innervasyon deseninin kapsamlı bir genel görünümünü sağlar, bu da seçici olarak savunmasız motor nöron havuzlarının tanımlanmasına izin verir. Bu kaslar ayrıca motor birim büyüklüğü, aksonal dallanma ve terminal/nodal filizleme gibi parametrelerin analizine izin verir. Bu tür kasların kullanılmasında yaygın bir engel, onları parçalamak için teknik uzmanlık kazanmaktır. Bu videoda, enine abdominis (TVA) kasının genç farelerden parçalanması ve aksonları ve nöromüsküler kavşakları (NMJ’ ler) görselleştirmek için immünoresans gerçekleştirme protokolünü detaylandırıyoruz. Bu tekniğin TVA kasının innervasyon paternine tam bir genel bakış sağladığını ve çocukluk çağı motor nöron hastalığı spinal müsküler atrofinin bir fare modelinde NMJ patolojisini araştırmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Introduction
Nöromüsküler kavşaklar (NMJs), daha düşük bir motor nöron ile iskelet kas lifi arasındaki sinaptik bağlantıdır. Geleneksel olarak bir nöron (presynaptik terminal), kas lifi (post sinaptik terminal) ve terminal Schwann hücre1’denoluşan üçlü bir sinaps olarak kabul edilirler. NMJ’ler, bir dizi motor nöron hastalığında ve fare modellerinde patolojide erken ve önemli hedefler olarak görünmektedir2,3. Tipik semptomlar, motor plakasının presynaptik bir innervasyondan yoksun hale geldiği denervasyon, presynaptik terminalin şişmesi ve NMJ morfolojisinin karmaşıklığında bir azalma4-11içerir. Aksional süreçlerin kalan sinaptik terminallerden veya internodlardan yeniden yağlanmış denervated uç plakalarına kadar uzandığı terminal ve nodal filizlemeyi içeren telafi edici yanıtlar da not edilebilir12,13. Sinaptik aktivite ve NMJ morfolojisi arasındaki sıkı korelasyon nedeniyle, NMJ morfolojisinin analizinden motor nöronların fonksiyonel durumu hakkında çok fazla bilgi edinilebilir. NMJ kaybı sıklıkla nöromüsküler patolojinin ilk yönlerinden birini temsil ettiği için4,10Innervasyon seviyesinde niceleme patolojinin ilerlemesi ve terapötik bir müdahalenin potansiyel etkisi hakkında önemli bilgiler verebilir. Ayrıca, NMJ kaybı patolojik ilerlemede önemli bir adımı temsil ettiği için, bağlantıları stabilize edebilecek ve yenilenmeyi teşvik edebilecek terapötiklerin geliştirilmesi önemli fayda sağlayabilir.
NMJ morfolojisi analiz edilirken kas seçimi büyük önem taşımaktadır. Başlıca hususlardan bazıları kas lifi tipi, vücut pozisyonu ve insan koşullarına karşılaştırmalı analiz içerebilir. Ek olarak, maddelerin enjeksiyonu veya travmatik sinir hasarı gibi manipülasyonların gerekli olduğu durumlarda, deneysel erişilebilirliği de göz önünde bulundurmak önemlidir. Genel olarak, vücut boyunca konumlandırılmış bir dizi kasın bir dizi motor ünite alt tipini yansıtması tercih edilir. Bununla birlikte, genellikle, kas seçimi diseksiyon kolaylığından etkilenir. Sonuç olarak, NMJ analizi genellikle sadece gastrocnemiusgibi büyük apandisit kaslarda gerçekleştirilir. Bu tür kaslarda iyi NMJ lekeleme elde etmek için, genellikle kas liflerinin bölümleme veya mekanik bozulması gerekir. Sonuç olarak, innervasyon paterni bozulabilir ve innervasyon paternlerinin, filizlenen ve denervasyonun kapsamlı ve kaliteli bir analizi genellikle tehlikeye girer. Alternatif bir yaklaşım, kesit gerektirmeyen ve lekelenebilen ve sağlam bir şekilde monte edilebilen ince düz kasların kullanılmasıdır ve bu da kasın tüm innervasyonuna kapsamlı bir genel bakış sağlar. Bir grup kranial kas da dahil olmak üzere böyle bir analiz için kullanılabilecek bir dizi kas vardır, (levator auris longus, auricularis superiorve adductor auris longus‘u kapsar)14, torasik kaslar (örneğin. üçgen sterni) 15ve abdominal(örneğin transversus abdominis (TVA)) kasları. Bu tür kasların kullanılmasındaki en büyük engel, onları hasarsız olarak parçalamak için gereken teknik uzmanlıktır.
Bu videoda, innervasyon paterninin ve NMJ morfolojisinin kapsamlı bir analizine izin vermek için TVA kasının fareden immünofluoresan etiketlemesini parçalamak ve gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz. TVA kası, karın kaslarının en derin tabakasını içeren ağırlıklı olarak yavaş bir seğirme kasıdır ve alt interkostal sinirler tarafından içselleştirilir. Önceki çalışmalar, çocukluk çağı motor nöron hastalığı spinal müsküler atrofinin (SMA) bir dizi fare modelinde ve erken başlangıçlı motor nöron dejenerasyonu4,16’nındiğer fare modellerinde patolojiye karşı sürekli olarak oldukça savunmasız olduğunu göstermiştir. Bu nedenle TVA’nın periferik nöropatilerde NMJ analizi için yararlı bir kas olduğunu öneriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu videoda, TVA kasının fareden diseksiyonu ve kas içindeki NMJ’lerin tüm montajlı immünofluoresan etiketlemesi için bir protokol detaylandırdık. Ayrıca bu kasın SMA’nın bir fare modelinde nöromüsküler kavşak patolojisini analiz etmek için kullanılabileceğini gösteren veriler sunuyoruz.
Bu teknikteki başarı bir dizi faktöre bağımlıdır. En yaygın sorunlardan bazıları aşağıda özetlenmiştir. İlk olarak: zayıf immünohistokimyasal lekeleme. Bunun bir dizi nedeni olabilir, en yaygın olanlardan biri, bu protokolde listelenenlere farklı reaktiflerin kullanılmasıdır. Bu protokolde listelenen antikorların seçimi gibi, iyi boyama sağlamak için yüksek kaliteli bir elektron mikroskopi sınıfı PFA çok önemlidir. Ek olarak, yaşlı hayvanlarda(yani3 ay >), kaliteli boyama almak daha zor olabilir. Bunun nedeni, kası çevreleyen fasyanın kalınlığının artması ve dış eğik ve tranversus abdominis arasındaki yağ birikiminin artmasıdır. İmmünoresansa geçmeden önce yağı çıkarmak önemlidir. Kalınlaşabilen kası kaplayan fasyanın bir kısmını çıkarmak da gerekebilir. Bazen kas lifine bir miktar zarar vermeden ve innervasyon düzeninde bir bozulma olmadan fasya ve yağı kastan çıkarmak zordur. Ancak bu teknik dikkatli bir şekilde yapılırsa farelerden en az 1 yaşına kadar kaliteli boyama elde edilebilir. Genç farelerde(yani3 aydan az) kas liflerinin herhangi bir alay veya ayrılmasını yapmak gerekli olmamalıdır. İkincisi: diseksiyon ve lekeleme sonrasında NMJ bulmakta zorluk. Bunun nedeni genellikle diseksiyonun son kaburganın altına uzanmamasıdır. NMJ’lerin çoğu son kaburganın hemen altında bulunur ve bu nedenle kasın bu kısmının diseksiyona dahil edilmesine dikkat edilmelidir. Üçüncüsü: EO kasının TVA kasına yapışmasını. Bu genellikle bireyler diseksiyonu iç eğik (GÇ) kas seviyesinin altına uzatmaya çalıştıklarında bir şikayettir. İO’nun da bulunduğu TVA kasının alanını analiz etmek daha zordur, çünkü hangi kasın hangisi olduğunu ayırt etmek zor olabilir. Bu nedenle, rutin olarak TVA kasının en üstün kısmını parçalara ayırıyoruz. Bu seviyede, EO ve TVA kasları arasında yapışma yoktur ve bu nedenle bu önemli bir sorun olmamalıdır.
TVA kasının kullanılmasının önemli bir engeli, apandisitrik kaslara kıyasla, cerrahi manipülasyonlar veya maddelerin enjeksiyonu için erişilebilirliktir. Bu tür deneyler, belirli bir kastaki NMJ fizyolojisini araştırmak için çok önemli olabilir. TVA kesinlikle tibialis ön veya gastrocnemiusgibi daha yaygın olarak kullanılan kaslardan daha az kolay erişilebilir olmasına rağmen, önceki çalışmalar TVA’yı interkostal sinirlerin cerrahi yaralanması ile denervate etmenin mümkün olduğunu göstermiştir18. Son zamanlarda bu kası genel anestezi altındaki maddelerin yerel yönetimi için de kullandık (yayınlanmamış veriler). Bu deneyler ılımlı bir teknik zorluğu temsil etse de, bu çalışma bunların mümkün olduğunu ve böylece hem patolojik hem de fizyolojik manipülasyon altında NMJ’lerin analizi için bu kasın yararlılığını genişlettiklerini göstermektedir.
TVA kası, innervasyon desenlerinin tam olarak monte analizi için kullanılabilecek vücut boyunca bulunan bir dizi ince düz kastan biridir. Diğer kaslar arasında, beyin sapının yüz çekirdeğinden kaynaklanan motor nöronlar tarafından içselleştirilmiş bir grup kranial kas, levator auris longus, auricularis superiorve adductor auris longus, diseksiyonları daha öncetanımlanmıştır 14,19. Ayrıca, EO, IO ve rectus abdominisde dahil olmak üzere TVA kasını çevreleyen kas yapısı da etiketlenebilir ve NMJ analizi için kullanılabilir. Bir fare modelinde NMJ patolojisinin kapsamlı analizi için, vücutta bulunan bir dizi kası göz önünde bulundurmak ve analizi tek bir kasla kısıtlamamak önemlidir. Bu, farklı kaslar arasındaki NMJ patolojisi seviyelerinde önemli heterojenliğin olduğu motor nöron hastalıklarının fare modellerinde örneklenmiştir20. Bu tür intermüsküler değişkenlik, motor nöron kırılganlığının mekanizmasını araştırırken son derece değerli bir araçtır ve bu nedenle analizi tek bir kasla kısıtlamak araştırmanın potansiyelini önemli ölçüde azaltabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri’nden (hibe numarası MOP 38040) R.K.’ye, Musküler Distrofi Derneği’nden (ABD) R.K.’ye, SMA ailelerinden R.K. ve L.M.M’a, SMA Trust’tan T.H.G.’ye ve Kas Distrofisi Kampanyası’ndan T.H.G.’ye hibelerle desteklendi. L.M.M, Kanada Multipl Skleroz Derneği Doktora Sonrası Bursu’nun alıcısıdır ve R.K. Ottawa Üniversitesi’nden Bir Üniversite Sağlık Araştırma Kürsüsü’nün alıcısıdır.
Materials
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Dupuis, L., Loeffler, J. P. Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).
- Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).
- Kariya, S., et al. Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).
- Iguchi, Y., et al. Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration. Brain. 136, 1371-1382 (2013).
- Martinez-Hernandez, R., et al. Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development. J. Pathol. 229, 49-61 (2013).
- Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy. Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).
- Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1). Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).
- Ang, E. T., et al. Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).
- Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. J. Vis. Exp. (4460), (2013).
- Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology. J. Anat. 213, 633-645 (2008).
- Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).
- Comley, L. H., et al. ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system. Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).
- Wright, M., Kim, A., Son, Y. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).
