ライブ培養神経細胞の抗体供給した後細胞表面および内在化タンパク質の異なる標識化

新たに同定されたタンパク質の機能を確立する上で、問題のタンパク質の細胞内局在や人身売買の調査は蛋白質^の1,2の可能性のある役割/ Sについての重要な手がかりを提供することができます。開発新皮質³のトランスクリプトームのバイオインフォマティクス解析は、マウス脳corticogenesis中に変更発現を示す遺伝子のリストを提供してくれました。次に、これらの遺伝子のうちの1つ、sez6によってコードされるタンパク質は、ニューロンの発達に重要な役割を有することを確認するために遺伝子ノックアウトアプローチを採用した。私たちは、発作関連遺伝子6、またはSez6、タンパク質は樹状突起の開発に位置しており、また、樹状突起棘、受信して興奮シグナルを統合し、樹状突起上の特殊な構造中に存在していることを観察した。このタンパク質が不足している場合にさらに、樹状突起および興奮性シナプスが正しく^4を形成することができない。タンパク質の考えが支配的アイソフォームはtransmembranの機能を備えていますE受容体は、免疫標識タンパク質の細胞内分布はほとんど共焦点顕微鏡によって、または免疫電子顕微鏡で調べたところ、が、全てではないが、信号の原形質膜上でラベルはほとんど、あるいは全く、タンパク質と細胞体のコンパートメントに小さな小胞に関連する登場細胞表面で。

明確に予測された大きな細胞外ドメインを有するこの推定上の受容体は原形質膜に輸送されることを示すために、我々は、細胞表面上のタンパク質を標識するタンパク質の細胞外部分に生成された抗血清を用いて生細胞のアプローチを採用した。広範なブロッキング工程および透過処理工程により分離示差的に標識された二次抗体の2つのアプリケーションは、この「抗体給餌」アプローチを組み合わせることで、異なるfluorescを有する蛍光標識二次抗体に結合することによって区別タンパク質の2つの異なるプールを識別することができたENTタグ。従って、我々は、細胞表面に残っまたはこの期間中に表面に輸送されたタンパク質のいずれかからの抗体のインキュベーション工程の間にエンドサイトーシスによって内在化されたタンパク質を区別することができた。この方法を用いて、関心対象のタンパク質が神経細胞で細胞表面との間で売買されていることを確立した。そのため、この比較的迅速かつ簡単な手法は、我々はすべてのこれらの技術に同じウサギポリクローナル抗血清を使用しているにもかかわらず、伝統的な免疫細胞化学法または事前に埋め込むイムノゴールド電子顕微鏡よりも多くの情報を証明した。この技術は、細胞外ドメインのエピトープを認識する優れた抗体が利用可能で提供される任意の膜貫通タンパク質に一般的に適用可能である。技術はグルタミン酸受容体のGluR1サブユニット⁵の受容体の輸送を研究するために以前に使用されています。