حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

ثنائي الفوتون الليزر المجهر (TPLSM)، مع مزاياها للتصوير الأنسجة العميقة المتصلة الأشعة تحت الحمراء فائقة قصيرة الإثارة نابض ^1، وقد رأينا ثورة على العمليات الحيوية على مستوى الخلية واحد من خلال الكشف عن الحركة والتفاعل أنماط مختلفة مجموعات فرعية الخلايا في الحيوانات التي تعيش ^2-5. ومع ذلك، التكنولوجيا الحالية لا تزال غير كافية لتوضيح آليات وظيفة الجهاز وضعف كشرط أساسي لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة، لأنه يجعل سوى معلومات قليلة حول الأساس الجزيئي للاستجابة الخلوية داخل أنسجة في الصحة والمرض. التكنولوجيا الحالية تتيح سوى نافذة المكاني لبضع مئات من ميكرون بسبب تناثر وموجة آثار تشويه الجبهة على القرار المكانية ونسبة الإشارة إلى الضوضاء ^6، والتي هي واضحة وخاصة في الأنسجة المدمجة للغاية من الحيوانات البالغة. هذه نثر وآثار موجة تشويه الجبهة هي نتيجة لوغير متجانسة للغايةتوزيع متباين الخواص د معامل الانكسار في الأنسجة، مما يؤدي في خطوة أولى إلى تدهور تعتمد عمق القرار المكانية 3D وأخيرا إلى فقدان تام للإشارة القادمة من الفوتونات الإثارة الباليستية، أي فقدان نسبة الإشارة إلى الضوضاء. من حيث bioscientific والطبية الحيوية التطبيقات الأنسجة العميقة، وهذا يعني أن التكنولوجيا الحالية غير قادرة على الكشف لا لبس فيه الاتصالات الخلوية بسبب ضعف القرار من شأنه أن يؤدي إلى تفاعلات إيجابية زورا حين أن انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء من شأنه أن يتسبب في النظام نغفل بعض التفاعلات بين الهياكل قاتمة.

من أجل الكشف عن التفاعلات الخلوية بشكل لا لبس فيه بطريقة ديناميكية، هناك حاجة إلى تحسين درجة عالية القرار المكانية عميقة داخل الأنسجة. تقنيات nanoscopy قوية أدخلت حاليا على أساس خوارزميات عددية خاصة، مثل النهج بنية الإضاءة، على استنفاد أول دولة متحمس، على سبيل المثال </em> STED، RESOLFT، أو على توطين جزيء، مثل dSTORM، النخيل، وقد وجدت العديد من التطبيقات في خلايا ثابتة وكذلك في مزارع الخلايا الحية ^7. ومع ذلك، من أجل توسيع نطاق هذه التطبيقات إلى أقسام الأنسجة، والأنسجة الحية والكائنات الحية ما زلنا بحاجة للتغلب على الصعوبات التقنية الشديدة. اثنين من الفوتون الإثارة STED مع أطوال موجية مختلفة وكذلك مع طول موجة واحدة (sw2PE-STED) عن الإثارة وحفز تم تطبيق القرار لتحسين الانبعاثات الجانبية في شرائح الدماغ ⁸ أو في مصفوفات اصطناعية مع خلايا جزءا لا يتجزأ من ^9، على التوالي، في نفس القرار المحوري كما TPLSM القياسية. باستخدام فوتون واحد STED، يمكن تصوير ديناميات العمود الفقري شجيري على سطح القشرة الدماغية (تصل إلى 10-15 ميكرومتر العمق) في لقمة العيش Thy1 EGFP الماوس في قرار من 67 نانومتر ^10. يتم توفير أداة مرنة للالبيولوجيا التطورية من متعدد البؤر المجهري منظم في الإضاءة، الذي يوفر تحسين شقين 2Dالقرار. ومع ذلك، هذه التقنية يمكن استخدامها فقط في الكائنات الحية مع الميل منخفضة من تشتت الضوء مثل أجنة سمك الزرد ^11. لا يزال، فإن أيا من هذه التقنيات يمكن تطبيقها في الأنسجة نثر عالية من الحيوانات البالغة في عدة مئات من ميكرومتر، والتي هي نماذج حاسمة للبحوث الطبية الحيوية والسريرية للأمراض، مع ظهور بعد الولادة.

مستقلة عن التقريب المستخدمة لحساب موجة شكل الجبهة محدودة الحيود، أي وظيفة انتشار نقطة (قوات الأمن الفلسطينية)، وبعد التركيز من خلال العدسة، والعرض من قوات الأمن الفلسطينية على طول المحور البصري (القرار المحوري) هو على الأقل ثلاث مرات أكبر من عرض PSF عمودي على المحور البصري (القرار الوحشي) ^12. موجة التشوهات أمام أوامر مختلفة كميا بواسطة معامل Zernike في تعديل كبير على شكل موجة من الموجات الكهرومغناطيسية الجبهة تركيزا في مجال التصوير الأنسجة العميقة مما يؤدي إلى أكبر من ذلك بكثير PSFS، وخصوصا على طول البصريةمحور آل ^13-15. وبالتالي، فإن القوانين حيود وآثار موجة التشويه أمامية على حد سواء تشير إلى قرار على طول المحور البصري كما العامل المحدد في التصوير الأنسجة العميقة. في حين أن التركيز على تقنيات nanoscopy مواجهة حدود الحيود فقط، هناك حاجة إلى التكنولوجيا مما يحسن القرار المحوري والتباين من خلال مواجهة كل من حيود والموجة الأمامية آثار التشويه عالية الدقة intravital التصوير. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون هذا الأسلوب أيضا سريع بما يكفي للسماح رصد ديناميات الخلوية.

التصحيح في الوقت الحقيقي من الانحرافات قوات الأمن الفلسطينية وفقدان التباين باستخدام البصريات التكيفية في TPLSM وقد درس على نطاق واسع وتحسينها في العقد الماضي ^{13،14،16-18} وبالتالي فإنه هو أفضل الخيارات المتاحة حاليا مما يؤدي إلى إدارة أفضل للالإثارة الباليستية فوتونات الضوء ^14. لا يزال، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن معظم موجة التصحيح الأمامي النهج المستخدمة في البصريات التكيفية هي تكرارية وأنهم هكتارلقد لتكرارها لمناطق صغيرة (10 × 10 بضعة ميكرومتر ²⁾ نظرا لعدم تجانس عالية من معامل الانكسار في الأنسجة، وسرعة اكتساب هو أقل بكثير مما هو ضروري لحركية الخلية التصوير والاتصالات. وعلاوة على ذلك، وتحسين الحد المادية في البصريات التكيفية-TPLSM لا يزال يحدده حيود.

التشكيل المكاني للإضاءة (SPIN) والتشكيل الزماني على الجانب الكشف (SPADE) وقد اقترحت نظريا ليتم تطبيقها على الليزر المجهر لتحسين القرار. التطبيق العملي في intravital التصوير ما زال يتعين تظاهر ^19.

أخذت معا، وهناك طلب كبير على تطوير التكنولوجيات، التي من شأنها تحسين القرار لتصوير الأنسجة العميقة في الحيوانات الحية الكبار. في هذا العمل، ونحن تحقيق التشكيل المكاني للنمط الإثارة عن طريق التحكم في عملية المسح متعددة الحزم في مخطط في الإضاءة متعدد الفوتون الليزر لياليتعليب المجهري (MB-SI-MPLSM) ^20. خلافا للنهج منظم الإضاءة، حيث يتم التضمين قسم الإثارة شعاع عبر مكانيا، ونحن نستخدم فقط عملية المسح لتحقيق التشكيل المكاني للإثارة. من خلال توسيع الإثارة إلى الطول الموجي الأطول، ونحن قادرون على تحسين كل من القرار المكانية ونسبة الإشارة إلى الضوضاء في عمق الأنسجة من نثر للغاية الأنسجة (مثل العقدة الليمفاوية، نثر حرة مسار 47 ميكرومتر ^6)، بصرف النظر عن بصري إشارة غير الخطية اكتشفنا، على سبيل المثال مضان، الجيل الثاني التوافقي أو تردد أخرى خلط الظاهرة. باستخدام هذا النهج في موجات الإثارة تصل إلى 900 نانومتر ونحن قادرون على حيوي صورة هياكل البروتين الخلوي على مقياس من جزيئات قليلة في مراكز جرثومي من الغدد الليمفاوية الماوس. وبالتالي، يمكننا تصور أفضل التفاعل بين وحدات المستضد تحمل على سطح الخلايا الجذعية الجريبي والخلايا B في عملية سبر المضادةجنرال خلال الاستجابة المناعية في الأجهزة اللمفاوية الثانوية.