Un método innovador para exosome cuantificación y medición de tamaño
Summary
A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Abstract
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Introduction
La función exacta de exosomas que circulan permaneció desconocido durante un largo período de tiempo. Incluso ahora el mecanismo de ruta completa de exosomas no se entiende completamente. Desde exosomas llevan principalmente se ha dado prioridad antígenos, proteínas y ARN (ARNm y miRNA) que los relaciona con su celular de sus padres de origen, su función como transmisores de señalización célula-célula.
Muchos métodos diferentes se han descrito en la literatura para el aislamiento y la detección cuantitativa de exosomas 1,2. Sin embargo, no se ha llegado a un consenso sobre un "patrón oro". Mientras tanto, la mayoría de los científicos que trabajan en el campo de la investigación exosome de acuerdo en que un método consistente de aislamiento es muy justificada para lograr un mayor grado de comparabilidad entre los distintos informes y estudios.
Fluorescencia clasificación de células activadas (FACS) es la herramienta más común y frecuente para el análisis exosome 3. FACS tiene el benbenefi- que, a través de etiquetado de fluorescencia, las células de diferentes orígenes se pueden comparar en un solo paso. Las principales desventajas de FACS son que este método no es lo suficientemente sensible para identificar las partículas menores de 0,5 micras 4, mientras que los exosomas son generalmente entre 30-120 nm de diámetro 5, menos aún para medir su tamaño.
Microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) son otras herramientas para el análisis de tamaño de partícula y la morfología de los exosomas. Sin embargo, tanto SEM y TEM tienen la desventaja de que la preparación de muestras consume mucho tiempo, ambos métodos implican pasos de trabajo intensivo y cada uno tiene un cierto riesgo de generación de artefactos. Ningún método es adecuado para la gran cantidad de muestras y caracterización de varios miles de partículas individuales de una muestra. Por otra parte, un análisis cuantitativo para la rutina diaria clínica donde las muestras tienen a menudo para ser analizada de manera simultánea o al menos en un período muy corto sedifícil de realizar. Técnicas de nueva generación ahora nos permiten analizar exosomas sin un intenso trabajo preparatorio previo (SEM por ejemplo, ambientales). Estas técnicas modernas son aún bastante incómodo para el análisis de grandes volúmenes de suspensiones que contienen los exosomas para determinar su promedio y distribución de tamaño 6.
Otro método muy sensible para la visualización y análisis de los exosomas es el análisis de nanopartículas de seguimiento (NTA). Este método se aprovecha de dos principios diferentes de la física. En primer lugar, las partículas son detectados por la luz dispersada cuando se irradian con un rayo láser. El segundo fenómeno se conoce como movimiento browniano, según la cual la difusión de diferentes partículas en una suspensión líquida es inversamente proporcional a su tamaño. En el último caso, el movimiento también depende de la temperatura y la viscosidad del líquido. Sin embargo, esta tasa está directamente relacionado con el tamaño de partícula y es utilizado por NTA. Utilizando suaveanálisis basado en cerámica, se graban las imágenes digitales de la luz dispersada de partículas individuales. Parcelas de puntos de luz repartidos y su velocidad de movimiento proporcionan los datos que facilite la determinación del recuento de partículas totales y distribución de tamaños. Esta técnica es particularmente potente para el análisis de partículas con un diámetro medio de menos de 100 nm.
Las mediciones de tamaño y la concentración se realizan con el ZetaView browniano y análisis de electroforesis de vídeo con movimiento microscopio. Este es un servicio de la parte superior de nanopartículas análisis instrumento semi-automatizado para muestras líquidas (en adelante, el instrumento de seguimiento de partículas). Consiste en el analizador de rastreo de partículas, así como un ordenador portátil con el software utilizado para el análisis de datos. Muestras biológicas heterogéneos son los adecuados para este método en forma de suspensiones más homogénea de partículas inorgánicas. Un microscopio de dispersión de láser con una cámara de vídeo se utiliza para la detección de partículas y para la OBSErvación de su movimiento. Mientras que el eje microscopio es horizontal y centrado en el canal de celda llena con una suspensión que contiene los exosomas, el haz de láser está orientado verticalmente. Las partículas irradiadas por la dispersión de la luz láser, que se contabilizan en 90 ° por una cámara de vídeo digital a través del microscopio (Figura 1). La intensidad de la luz dispersada permite la observación de partículas mayores de 60 nm de diámetro. En tal escenario el brillo de una partícula no es la única indicación de tamaño de partícula. Cuando no se aplica campo eléctrico, el movimiento de partículas sólo sigue el movimiento browniano y puede servir como un indicador para el cálculo de tamaño de partícula. Sin embargo, el instrumento también es capaz de aplicar un campo eléctrico a través del canal de la célula. Cuando se somete a este campo, el potencial, la polaridad y el nivel de iónicos cargo de los exosomas suspendidos vuelven más determinantes de la dirección de su movimiento. La velocidad y la dirección resultado en un mo electroforéticahistograma bilidad.
Mientras que encontrar un método óptimo para analizar exosomas aisladas es un problema, otro radica en el aislamiento eficaz de los exosomas de diferentes medios de comunicación, tales como la sangre, ascitis, orina, leche, líquido amniótico o medios de comunicación celular. Diferentes métodos han sido descritos hasta ahora, que se basa en la ultracentrifugación 1, reactivos de separación industriales (tales como Exoquick) 7, perlas magnéticas para el antígeno empleando separación 8 o ultrafiltración 9 pasos.
En este protocolo se demuestra todo el proceso de aislamiento exosome mediante ultracentrifugación y mostramos cómo analizar la exosome resultante que contiene la suspensión a través del instrumento de seguimiento de partículas. Se proporcionan consideraciones específicas para el análisis de un medio de plasma o cultivo de células humanas exosomas derivados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se demuestra un protocolo detallado para el aislamiento exosome de la sangre y el presente seguimiento de nanopartículas como una novela y método innovador para medir el tamaño exosome y la concentración en un fluido biológico. En los experimentos presentados se utilizó sangre periférica humana como el origen de los exosomas. Sin embargo, otros orígenes, tales como orina, esputo, sobrenadante de cultivo celular, etc., también pueden ser utilizados como material de prueba.
En base a la variabilidad biológica de la concentración de exosome en los seres humanos, ensayos de distintos individuos pueden ofrecer una concentración notablemente variable de exosomas. Sin embargo, la concentración de partículas en la sonda de prueba biológica puede tener un impacto en los resultados. Por lo tanto, se necesita un enfoque fiable y estandarizado para la dilución de las sondas. En el método presentado exosome que contiene el plasma se genera a partir de 9 ml de sangre entera periférica. El uso de centrifugación diferencial pasos un pellet exosome fue aislado de1 ml de plasma y se resuspendieron en 5 ml de agua destilada para dar lugar a la muestra de trabajo de los exosomas en suspensión. Este ajuste predefinido nos ha provisto de una concentración adecuada de partículas, es decir, la intensidad de dispersión apropiada durante NTA. Al lado el aspecto volumen y la dilución, la composición de las soluciones que se utilizan es también de importancia. Hemos utilizado el agua destilada para la final de resuspensión de exosomas. Por supuesto, también se pueden usar diferentes medios para la etapa de dilución final, de acuerdo con los requisitos de la instalación experimental. Sin embargo, en el caso de las mediciones de potencial zeta de soluciones iónicas, particularmente cuando el análisis de muestras con una capacidad de amortiguación, una dilución prudente en condiciones libres de turbulencia es útil. Para la comparación directa de múltiples muestras se recomienda mantener el mismo nivel de dilución para todas las muestras. Todos los ajustes excepto la sensibilidad y la resolución de vídeo se puede cambiar posteriormente utilizando el software de análisis ZetaView.
<p class="Jove_content"> A pesar de que los autores creen que el sistema establecido en el presente documento en la actualidad representa el instrumento más adecuado, no es el único sistema NTA disponible. Una serie de informes anteriores han empleado otros sistemas que se aplican los mismos principios NTA pero proporcionan otro diseño de instrumentos que va junto con algunas características diferentes 10. Creemos que los aspectos prácticos relativos a la manipulación de la muestra y la reproducibilidad de los resultados son de importancia central en la elección de la secuencia metodológica para la evaluación exosome. También creemos que un sistema de detección ideal debería eliminar los factores-dependiendo de usuario que pueden interferir con los resultados de las mediciones. El enfoque de análisis exosome que se presenta aquí cumple el criterio de fácil manejo en un alto grado. Como ventaja adicional, el análisis semi-automatizado de las muestras se realiza en un proceso rápido, generando resultados en un corto tiempo. Una visualización en línea de exosomas ayuda al analizador para gaen una idea inmediata de las características exosome, por ejemplo, la concentración bruta.Una adición muy simple pero elegante para la técnica de medición que se presenta aquí es el uso de anticuerpo marcado exosomas y la captura del rayo láser dispersada por el uso de un filtro anterior en frente del detector. De esta manera subpoblaciones exosome pueden distinguirse en función de sus antígenos de superficie y otras características de importancia biológica que son técnicamente accesibles a una tinción fluorescente selectiva.
Una desventaja de la versión actual de nuestro instrumento de rastreo de partículas es el hecho de que en niveles muy altos de sensibilidad artefactos, tales como ruido de fondo pueden convertirse en la actualidad, que se basa en la pared del canal de la célula. Una solución técnica y la mejora del sistema actual podrían estar disponibles en un futuro próximo. Por este método reflejos de la luz de dispersión láser en la pared del canal se reducirá, lo que aumenta la precisión de las señales medidas y los datos obtenidos y la reducción del límite de detección.
Aunque el protocolo utilizado actualmente para el aislamiento exosome está bien establecida y el instrumento de rastreo de partículas aplicado tiene una resolución muy precisa con una distribución de tamaño menor de 30 nm, no hay garantía de que las partículas detectadas son de hecho totalmente cierto exosomas. Otras partículas, tales como fragmentos de células muertas o complejos de proteínas más grandes también pueden estar presentes en la suspensión exosome y dar lugar a falsas señales positivas. Un método fiable en la cual tal "contaminación" se puede excluir puede ser microscopía electrónica (EM), microscopía electrónica de transmisión o EM escaneo. Desafortunadamente, no hay marcador general y específica para los exosomas se ha identificado hasta ahora, aunque una serie de marcadores de superficie previamente propuestos han ganado una cantidad cada vez mayor de la atención, incluyendo tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, etc. 11.
"> Independientemente del futuro progreso de la investigación en biología exosome, especialmente en relación con marcadores específicos exosome, el protocolo que se presenta aquí proporcionará un poderoso método para el aislamiento y detección de exosomas. La concentración y el tamaño pueden ser determinadas fácilmente en un software asistida moda sencillo. La adición de marcadores fluorescentes selectivos o anticuerpos fluoróforo unido probablemente mejorarán aún más las posibles aplicaciones del enfoque presentado de NTA.Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Materials
| Name of the Reagent | |||
| Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
| Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
| Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
| Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
| Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
| Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
| Material Name | |||
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |
References
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. , e3037 (2012).
- Konokhova, A. I., et al. Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles. Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).
- Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).
- Carr, B., Warren, J. Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology. Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. International immunology. 17, 879-887 (2005).
