Agroinfiltrering och PVX agroinfektion är rutinmässiga funktionella analyser för övergående ectopic uttryck av gener i växter. Dessa metoder är effektiva analyser i effektoromics strategier (snabb resistens och avirulens gen upptäckt) och avgörande för modern forskning inom molekylär växtpatologi. De uppfyller efterfrågan på robust funktionsanalys med hög genomströmning i växter.
Agroinfiltrering och PVX-agroinfektion är två effektiva övergående uttrycksanalyser för funktionell analys av kandidatgener hos växter. Det vanligaste medlet för agroinfiltrering är Agrobacterium tumefaciens, en patogen hos många dicotväxtarter. Detta innebär att agroinfiltrering kan tillämpas på många växtarter. Här presenterar vi våra protokoll och förväntade resultat när vi tillämpar dessa metoder på potatisen (Solanum tuberosum), dess relaterade vilda knölbärande Solanum-arter (Solanum-sektionen Petota) och modellväxten Nicotiana benthamiana. Förutom funktionell analys av enstaka gener, såsomresistens( R ) eller avirulens(Avr)gener, är agroinfiltreringsanalysen mycket lämplig för att rekapitulera R-AVR-interaktioner som är associerade med specifika värdpatogeninteraktioner genom att helt enkelt leverera R- och Avr-transgener till samma cell. Vissa växtgenotyper kan dock höja ospecificerade försvarssvar på Agrobacterium, som vi observerade till exempel för flera potatisgenotyper. Jämfört med agroinfiltrering är detektion av AVR-aktivitet med PVX-agroinfektion känsligare, mer hög genomströmning i funktionella skärmar och mindre känslig för ospecificerade försvarssvar på Agrobacterium. Men ospecificerat försvar till PVX kan uppstå och det finns en risk att missa svar på grund av virusinducerad extrem resistens. Trots sådana begränsningar är agroinfiltrering och PVX-agroinfektion enligt vår erfarenhet både lämpliga och kompletterande analyser som kan användas samtidigt för att bekräfta varandras resultat.
Effectoromics, en funktionell genomikmetod med hög genomströmning har nyligen dykt upp som ett kraftfullt verktyg för att identifieraresistens (R)gener i växtväxter och matchande avirulens(Avr)gener av patogener1-4. I motsats till den mer tidskrävande stabila omvandlingen med R-gener baseras effectoromics-strategin på övergående analyser av patogengensekvenser.
Sedan genomik-eran har genom av växtpatogener utforskats i stor utsträckning. Till exempel för oomycetes, som inkluderar de mest förödande växtpatogenerna, har stora samlingar av sekvenser genererats och analyserats för gener som spelar en roll under interaktionen medväxten 5-10. En klass av patogenproteiner representerar effektorer, som manipulerar värdcellens struktur och funktion antingen för att underlätta infektion (virulensfaktorer) eller för att utlösa försvarssvar (avirulensfaktorer)11-13. Uttryck av Avr-gener i växtceller som innehåller R-gener resulterar vanligtvis i överkänslig celldödsrespons (HR)14,15. I planta uttryck av R och Avr gener kan åstadkommas med hjälp av övergående uttryck system såsom Agrobacterium tumefaciens –baserad övergående omvandling (agroinfiltration)16. Denna övergående omvandling kan också tillämpas i kombination med virusuttryckssystem (agroinfektion)17,18.
För agroinfiltrering är det vanligaste medlet A . tumefaciens, en bred värdområdespatogen hos dicotväxter. A . tumefaciens innehåller en tumörframkallande (Ti) plasmid. Överförings-DNA (T-DNA) från en Ti-plasmid kommer att flyttas till växtcellerna efter att bakteriens virulensmaskineri har aktiverats. Detta kan utlösas i sårade växtceller, av de frigjorda fenolföreningarna med låg molekylvikt och monosackaraides i en något sur miljö19. Virulensgenen aktiveras efter infiltration av Agrobacterium suspensioner i bladpaneler definierade av stora vener. Då kommer växtceller i bladpanelerna att omvandlas och uttrycka de transgener som finns i T-DNA-regionen.
Agroinfection är baserad på sårinokerat agrobakterie, som förmedlar flyttning av ett virus till växtceller. Viruset sprider sig sedan vidare till angränsande växtvävnader, i avsaknad av Agrobacterium. För agroinfektion kan flera växtvirus användas. RNA-virus är idealiska vektorer för genuttryck eftersom de kan föröka sig till mycket höga nivåer i infekterade växter. Bland växt-RNA-virus används Potato Virus X (PVX) ofta för effectoromics skärmar. För att underlätta funktionella tester för en infogad gen klonades binära vektorer som innehåller PVX-genomet flankerade av blomkålsmosaikviruset 35S-promotorn och nopaline syntasterminatorn till T-DNA av A. tumefaciens20. Efter att T-DNA har överförts till växtceller transkriberas PVX-genomet i T-DNA från 35S-promotorn. Sedan sprids viruspartiklar systemiskt i de infekterade växterna, vilket resulterar i uttrycket av den infogade genen. Denna metod baserad på både Agrobacterium och PVX kallas PVX agroinfection.
Här visar vi exempel för både agroinfiltrering och PVX agroinfection analyser. Som värdväxter använder vi potatisgroddsplasma(Solanum-sektionen Petota), för vilken effektoromicsmetoder har banat väg och visat sig varaframgångsrika 3,4. Vi använder också Nicotiana benthamiana, som är känd som en modellväxt i Solanaceous växter14,21,22.
Övergående analyser som agroinfiltrering och agroinfektion är effektiva metoder som är avgörande för modern molekylär växtpatologiforskning. Trots vissa begränsningar uppfyller dessa metoder efterfrågan på effektiv och robust funktionsanalys med hög genomströmning i växter.
Agroinfiltreringssystemet är en allmänt använd funktionell analys i en rad växtarter. Agroinfiltrering underlättar leveransen av flera transgener till samma cell med samtidiga uttryck av interagerande proteiner. Detta är fördelaktigt för att rekapitla R-AVR-relationer, genom att myntfiltra agrobakterier som uttrycker Avr-gener med stammar som uttrycker de matchande R-generna. För kända R-AVR-par kan sådana myntfiltreringar också användas som positiva kontroller. Att inkludera sådana kontroller är viktigt eftersom omvandlingseffektiviteten i vissa växtgenotyper kan ligga under tröskelvärdet för att upptäcka svar. Att inkludera negativa kontroller, t.ex. en Agrobacterium stam som innehåller en vektor utan en geninsats, är också viktigt för att avgöra om en viss växt genotyp höjer ospecificerade försvarssvar på Agrobacterium. Denna funktion förekommer vid en viss frekvens i potatisgroddsplasma, och inte alla Solanum-arter är väl lämpade för detta Agrobacterium-baseradeuttryckssystem. I allmänhet fungerar agroinfiltreringsanalysen mycket bra i N. benthamiana och de flesta potatisgenotyper. Förutom effectoromics finns det olika andra potentiella tillämpningar för agroinfiltreringstekniken, såsom produktion av proteiner från transgener och proteinlokalisering i växtceller genom konfokal mikroskopi.
PVX agroinfection är ett mycket känsligt screeningsystem och vanligtvis mer lämpligt för screening med hög genomströmning. Eftersom Agrobacterium nu bara är lokalt närvarande, är ospecificerade svar på denna bakterie nu inte särskilt störande, eftersom PVX-viruset tar över ytterligare spridning av transgenen. Växter kan dock vara resistenta mot PVX eller montera extrema motståndssvar (ER), och i så fall är agroinfection-metoden inte lämplig. En annan begränsning av PVX agroinfection-metoden är skärstorleken på den gen som är av intresse. Observerade fenotyper av svar kan variera från en intensiv svart nekros som omger såret till svag nekros nära vaccinationspunkten. I både N. benthamiana och Solanum arter, PVX agroinfection erkänns som känsligare än agroinfiltration.
Med tanke på att den genetiska bakgrunden hos de olika testade växtgenotyperna kan ha vissa begränsningar (se ovan), får vi i allmänhet liknande slutsatser av PVX-agroinfektion och agroinfiltrering. Dessa resultat är också jämförbara som erhållits i andra analyser, såsom proteininfiltrationer29 och ELISA3. Med tanke på fördelarna och begränsningarna med båda systemen rekommenderar vi att du använder båda metoderna för att antingen komplettera varandra eller bekräfta oberoende resultat.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöds delvis av Wageningen University Fund (WUF), China Scholarship Council Program for Graduate Students och ett NWO-VIDI-anslag 12378.
Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
Incubator | Infors HT | Multitron II | |
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |