एग्रोइनफिल्ट्रेशन और पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन पौधों में जीन की क्षणिक एक्टोपिक अभिव्यक्ति के लिए नियमित कार्यात्मक परख हैं। ये विधियां प्रभावरोक्रॉमिक्स रणनीतियों (तेजी से प्रतिरोध और एविबुलेंस जीन खोज) में कुशल परख हैं और आणविक संयंत्र विकृति में आधुनिक अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं। वे पौधों में मजबूत उच्च-थ्रूपुट कार्यात्मक विश्लेषण की मांग को पूरा करते हैं।
एग्रोइनफिल्ट्रेशन और पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन पौधों में उम्मीदवार जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए दो कुशल क्षणिक अभिव्यक्ति परखते हैं। एग्रोइनफर्टेशन के लिए सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला एजेंट एग्रोबैक्टीरियम टमेफैपियंस है, जो कई डिकॉट पौधों की प्रजातियों का एक रोगजनक है। इसका मतलब यह है कि कृषि कीटाणुयुक्त कई पौधों की प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है। यहां, हम आलू(सोलनम ट्यूबरोसम),इसके संबंधित जंगली कंद-असर सोलनम प्रजातियों (सोलनम खंड पेटोटा)और मॉडल संयंत्र निकोटियाना बेंथामियानाके लिए इन तरीकों को लागू करते समय अपने प्रोटोकॉल और अपेक्षित परिणाम प्रस्तुत करते हैं। एकल जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के अलावा, जैसे प्रतिरोध(आर)याएवीआर (एवीआर)जीन, एग्रोइनफिल्ट्रेशन परख एक ही कोशिका में आर और एवीआर ट्रांसजीन वितरित करके विशिष्ट मेजबान रोगजनक इंटरैक्शन से जुड़े आर-एवीआर इंटरैक्शन को फिर से शुरू करने के लिए बहुत उपयुक्त है। हालांकि, कुछ पौधे जीनोटाइप एग्रोबैक्टीरियमके लिए गैर-विशिष्ट रक्षा प्रतिक्रियाएं बढ़ा सकते हैं, जैसा कि हमने उदाहरण के लिए कई आलू जीनोटाइप के लिए देखा था। एग्रोइंफिल्ट्रेशन की तुलना में, पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन के साथ एवीआर गतिविधि का पता लगाना अधिक संवेदनशील है, कार्यात्मक स्क्रीन में अधिक उच्च थ्रूपुट और एग्रोबैक्टीरियमके लिए गैर-विशिष्ट रक्षा प्रतिक्रियाओं के प्रति कम संवेदनशील है। हालांकि, पीवीएक्स के लिए गैर-विशिष्ट रक्षा हो सकती है और वायरस-प्रेरित चरम प्रतिरोध के कारण प्रतिक्रियाओं को याद करने का जोखिम है। ऐसी सीमाओं के बावजूद, हमारे अनुभव में, एग्रोइनफिल्ट्रेशन और पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन दोनों उपयुक्त और पूरक परख हैं जिनका उपयोग एक दूसरे के परिणामों की पुष्टि करने के लिए एक साथ किया जा सकता है।
प्रभावरोमिक्स, एक उच्च-थ्रूपुट कार्यात्मक जीनोमिक्स दृष्टिकोण हाल ही में फसल पौधों में प्रतिरोध(आर)जीन की पहचान करने और रोगजनकों केएवीआर (एवीआर)जीन1-4से मेल खाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है। आर जीन के साथ अधिक समय लेने वाले स्थिर परिवर्तन के विपरीत, प्रभावमोरोमिक्स रणनीति रोगजनक जीन दृश्यों के क्षणिक परख पर आधारित है।
जीनोमिक्स युग के बाद से, पौधों के रोगजनकों के जीनोम का व्यापक रूप से पता लगाया गया है। उदाहरण के लिए oomycetes के लिए, जिसमें सबसे विनाशकारी पौधे रोगजनक शामिल हैं, दृश्यों के बड़े संग्रह उत्पन्न किए गए हैं और जीन के लिए विश्लेषण किया गया है जो पौधे5-10के साथ बातचीत के दौरान भूमिका निभाते हैं। रोगजनक प्रोटीन का एक वर्ग प्रभावकों का प्रतिनिधित्व करता है, जो मेजबान कोशिका संरचना में हेरफेर करता है और या तो संक्रमण (उग्रता कारकों) को सुविधाजनक बनाने के लिए या रक्षा प्रतिक्रियाओं (avirulence कारकों)11-13को ट्रिगर करने के लिए कार्य करता है। आर जीन युक्त पौधों की कोशिकाओं में एवीआर जीन की अभिव्यक्ति आमतौर पर अतिसंवेदनशील कोशिका मृत्यु प्रतिक्रिया (एचआर)14,15में परिणाम देती है। आर और एवीआर जीन की प्लांटा अभिव्यक्ति में एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफैडियन्सआधारित क्षणिक परिवर्तन (एग्रोइनफर्टेशन)16जैसे क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है । इस क्षणिक परिवर्तन को वायरल अभिव्यक्ति प्रणालियों (एग्रोइंफेक्शन)17,18के संयोजन में भी लागू किया जा सकता है।
एग्रोइनफिल्ट्रेशन के लिए, सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला एजेंट ए. टमेफैपियंस है, जो डिकोट पौधों का एक व्यापक मेजबान रेंज रोगजनक है। A. tumefaciens एक ट्यूमर उत्प्रेरण (Ti) प्लाज्मिड होता है । एक Ti plasmid से डीएनए हस्तांतरण (टी डीएनए) जीवाणु की उग्रता मशीनरी सक्रिय होने के बाद संयंत्र कोशिकाओं में स्थानांतरित हो जाएगा । यह थोड़ा अम्लीय वातावरण19में जारी कम आणविक वजन फेनोलिक यौगिकों और मोनोसाकैराइड्स द्वारा घायल पौधों की कोशिकाओं में ट्रिगर किया जा सकता है। प्रमुख नसों द्वारा परिभाषित पत्ती पैनलों में एग्रोबैक्टीरियम निलंबन की घुसपैठ के बाद उग्रता जीन सक्रिय हो जाता है। फिर पत्ती पैनलों में पौधों की कोशिकाओं को बदल दिया जाएगा और टी-डीएनए क्षेत्र में निहित ट्रांसजीन (ओं) को व्यक्त किया जाएगा।
एग्रोइंफेक्शन घाव-टीका लगाए गए एग्रोबैक्टीरियमपर आधारित है, जो पौधों की कोशिकाओं में वायरस के स्थानांतरण में मध्यस्थता करता है। वायरस तो आगे आसन्न संयंत्र ऊतकों में फैलता है, एग्रोबैक्टीरियमकी अनुपस्थिति में । एग्रोइंफेक्शन के लिए कई प्लांट वायरस का इस्तेमाल किया जा सकता है। आरएनए वायरस जीन अभिव्यक्ति के लिए आदर्श वैक्टर हैं क्योंकि वे संक्रमित पौधों में बहुत उच्च स्तर तक गुणा कर सकते हैं। संयंत्र आरएनए वायरस के बीच, आलू वायरस एक्स (PVX) व्यापक रूप से प्रभावप्रभाव स्क्रीन के लिए प्रयोग किया जाता है। एक डाला जीन के लिए कार्यात्मक परीक्षणों की सुविधा के लिए, बाइनरी वैक्टर जिसमें पीवीएक्स जीनोम फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35S प्रमोटर और नोलाइन सिंथेस टर्मिनेटर द्वारा घिरा हुआ होता है, को ए tumefaciens20के टी-डीएनए में क्लोन किया गया था। टी-डीएनए को पौधों की कोशिकाओं में स्थानांतरित करने के बाद, टी-डीएनए में निहित पीवीएक्स जीनोम को 35S प्रमोटर से लिखा जाता है। फिर वायरस के कण संक्रमित पौधों में व्यवस्थित रूप से फैलते हैं, जिसके परिणामस्वरूप डाला गया जीन की अभिव्यक्ति होती है। एग्रोबैक्टीरियम और पीवीएक्स दोनों पर आधारित इस विधि को पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन कहा जाता है।
यहां हम एग्रोइंटरफर्टेशन और पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन परख दोनों के लिए उदाहरण दिखाते हैं। मेजबान पौधों के रूप में हम आलू के जर्मप्लाज्म(सोलनम खंड पेटोटा)का उपयोग करते हैं , जिसके लिए प्रभावरोमिक्स दृष्टिकोण का बीड़ा उठाया गया है और सफल साबित हुआ है3,4. हम निकोटियाना बेंथामियानाका भी उपयोग करते हैं , जो सोलनसियस पौधों में एक मॉडल पौधे के रूप में प्रसिद्ध है14,21,22.
कृषि कीटाणुशोधन और कृषि कीटाणुशोधन जैसे क्षणिक परख कुशल तरीके हैं जो आधुनिक आणविक संयंत्र विकृति अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं। कुछ सीमाओं के बावजूद, ये विधियां पौधों में कुशल और मजबूत उच्च-थ्रूपुट कार्यात्मक विश्लेषण की मांग को पूरा करती हैं।
कृषि निगम प्रणाली पौधों की प्रजातियों की एक श्रृंखला में एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली कार्यात्मक परख है। एग्रोइनफिल्ट्रेशन कई ट्रांसजीन को एक ही कोशिका में वितरण की सुविधा प्रदान करता है जिसमें एक साथ प्रोटीन की अभिव्यक्ति होती है। यह आर-एवीआर संबंधों को फिर से शुरू करने के लिए फायदे वाला है, कॉइनफिल्टिंग एग्रोबैक्टीरियम उपभेदों द्वारा जो मिलान आर जीन को व्यक्त करने वाले उपभेदों के साथ एवीआर जीन को व्यक्त करते हैं। इसके अलावा, ज्ञात आर-एवीआर जोड़े के लिए, इस तरह के कॉइनफिल्ट्रेशन का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है। इस तरह के नियंत्रण शामिल महत्वपूर्ण है क्योंकि कुछ संयंत्र जीनोटाइप में, परिवर्तन दक्षता प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए दहलीज से नीचे हो सकता है । नकारात्मक नियंत्रण सहित, उदाहरण के लिए एक जीन डालने के बिना वेक्टर युक्त एग्रोबैक्टीरियम तनाव, यह निर्धारित करने के लिए भी आवश्यक है कि क्या एक निश्चित पौधे जीनोटाइप एग्रोबैक्टीरियमके लिए गैर-विशिष्ट रक्षा प्रतिक्रियाएं उठाता है या नहीं। यह सुविधा आलू के जर्मप्लाज्म में एक निश्चित आवृत्ति पर होती है, और सभी सोलनम प्रजातियां इस एग्रोबैक्टीरियम-आधारितअभिव्यक्ति प्रणाली के लिए अच्छी तरह से उपयुक्त नहीं हैं। आम तौर पर, एग्रोइनफिल्ट्रेशन परख एन बेंथामियाना और अधिकांश आलू जीनोटाइप में बहुत अच्छी तरह से काम करती है। प्रभावमोक्रिया के अलावा, एग्रोइंफिल्ट्रेशन तकनीक के लिए विभिन्न अन्य संभावित अनुप्रयोग हैं, जैसे ट्रांसजीन से प्रोटीन का उत्पादन और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पौधों की कोशिकाओं में प्रोटीन स्थानीयकरण।
पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन एक बेहद संवेदनशील स्क्रीनिंग सिस्टम है और आमतौर पर हाई-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अधिक उपयुक्त है। चूंकि एग्रोबैक्टीरियम अब केवल स्थानीय रूप से मौजूद है, इसलिए इस जीवाणु के लिए गैर-विशिष्ट प्रतिक्रियाएं अब बहुत परेशान नहीं हैं, क्योंकि पीवीएक्स वायरस ट्रांसजीन के आगे फैल जाता है। हालांकि, पौधे पीवीएक्स, या माउंट एक्सट्रीम रेजिस्टेंस (ईआर) प्रतिक्रियाओं के लिए प्रतिरोधी हो सकते हैं, और उस स्थिति में एग्रोइंफेक्शन विधि उपयुक्त नहीं है। पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन विधि की एक और सीमा ब्याज के जीन का डालने का आकार है। प्रतिक्रियाओं के मनाया फेनोटाइप घाव के आसपास के एक तीव्र काले परिगलन से भिंन हो सकते हैं टीका स्थान के पास बेहोश परिगलन के लिए। एन बेंथामियाना और सोलनम दोनों प्रजातियों में, पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन को एग्रोइनफिल्टेशन की तुलना में अधिक संवेदनशील माना जाता है।
ध्यान में रखते हुए कि विविध परीक्षण संयंत्र जीनोटाइप की आनुवंशिक पृष्ठभूमि में कुछ प्रतिबंध हो सकते हैं (ऊपर देखें), हम आम तौर पर पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन और एग्रोइनफिल्ट्रेशन द्वारा समान निष्कर्ष प्राप्त करते हैं। इन परिणामों को अन्य परख में प्राप्त के रूप में भी तुलनीय हैं, जैसे प्रोटीन घुसपैठ29 और एलिसा3। दोनों प्रणालियों के फायदों और सीमाओं को ध्यान में रखते हुए, हम दोनों तरीकों का उपयोग करने के लिए या तो एक दूसरे के पूरक या स्वतंत्र परिणामों की पुष्टि करने की सलाह देते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
काम आंशिक रूप से Wageningen विश्वविद्यालय कोष (WUF), स्नातक छात्रों के लिए चीन छात्रवृत्ति परिषद कार्यक्रम, और एक NWO-VIDI अनुदान १२३७८ द्वारा समर्थित है ।
Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
Incubator | Infors HT | Multitron II | |
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |