Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Amy H. Van Hove; Brandon D. Wilson; Danielle S. W. Benoit

doi:10.3791/50890

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

화학

Functionalization בסיוע מיקרוגל של פולי (אתילן גליקול) ופפטידים על השרף לשימוש בPolymerizations שרשרת וגיבוש Hydrogel

Published: October 29, 2013

doi:

10.3791/50890

Amy H. Van Hove¹, Brandon D. Wilson², Danielle S. W. Benoit^1,2,3

¹Department of Biomedical Engineering,University of Rochester, ²Department of Chemical Engineering,University of Rochester, ³Center for Musculoskeletal Research,University of Rochester Medical Center

Summary

בסרטון זה ידגים שיטה מהירה, יעילה לmethacrylate פולי (אתילן גליקול), המאפשר polymerizations שרשרת וסינתזת הידרוג'ל. זה ידגים כיצד להציג את פונקציות methacrylamide דומות לפפטידים, שיטות אנליטיות נפוצות פרטים כדי להעריך את יעילות functionalization, לספק הצעות לפתרון בעיות ושינויים מתקדמים, ולהדגים טכניקות אפיון הידרוג'ל טיפוסיות.

Abstract

אחד היתרונות העיקריים באמצעות פולי (אתילן גליקול) (PEG) macromers בהיווצרות הידרוג'ל הוא צדדיות סינטטי. היכולת לצייר מתוך מגוון גדול של משקולות מולקולריות PEG ותצורות (מספר זרוע, זרוע באורך, ודפוס הסתעפות) מאפשר פיקוח הדוק על חוקרים וכתוצאה מכך מבני הידרוג'ל ומאפיינים, ובם מודול יאנג וגודל רשת. בסרטון זה ידגים שיטה מהירה, יעילה, ממס ללא, בסיוע מיקרוגל לmethacrylate מבשרי PEG לתוך פולי dimethacrylate (אתילן גליקול) (PEGDM). שיטה סינתטית זה מספקת חומרי המוצא נחוצים ליישומים במשלוח סמים ורפואה רגנרטיבית. השיטה הוכיחה עדיפה על שיטות methacrylation מסורתיות כפי שהוא מהיר יותר באופן משמעותי ופשוט יותר, כמו גם חסכוני יותר וידידותי לסביבה, תוך שימוש בכמויות קטנות יותר של חומרים כימיים וממסים. אנחנו גם נדגים התאמה של טכניקה זו לmethacr על השרףfunctionalization ylamide של פפטידים. שיטה על שרף זה מאפשרת N-הסופית של פפטידים להיות פונקציונליות עם קבוצות methacrylamide לפני deprotection ומחשוף משרף. זה מאפשר בנוסף סלקטיבית של קבוצות methacrylamide לN-Termini של פפטידים ואילו חומצות אמינו עם קבוצות בצד תגובתי (אמין לדוגמא העיקרית של ליזין, אלכוהול ראשוני של סרין, כהלים משניים של תראונין, ופנול של טירוזין) נותרות מוגנות, מניעת functionalization באתרים מרובים. מאמר זה יהיה פירוט שיטות אנליטיות נפוצה (ספקטרוסקופיה פרוטון תהודה מגנטית גרעינית ^(; H-NMR) ומטריקס בסיוע לייזר Desorption יינון זמן של ספקטרומטריית מסת טיסה (MALDI-TOF)) על מנת להעריך את היעילות של functionalizations. מלכודות נפוצות והציע שיטות לפתרון בעיות יטופלו, כמו שינויי רצונו של הטכניקה שבה ניתן להשתמש כדי פונקציונלי macromer המנגינה עוד יותר וכתוצאה מכך הידרוג'ל פיסיקלי וכימימאפיינים. שימוש במוצרים מסונתזים להיווצרות של הידרוג עבור משלוח תרופות ומחקרי אינטראקציה תא חומר יהיה הפגינו, עם תשומת לב מיוחדת שילמה לשינוי הרכב הידרוג'ל להשפיע על גודל רשת, שליטה נוקשות הידרוג'ל ושחרור תרופה.

Introduction

הידרוג פולי (אתילן גליקול) (PEG) הם חומרים ביולוגיים נפוצים בשימוש ביישומי רפואת רגנרטיבית ואספקת הסמים ^1-3. הידרוג אלה מציעים יתרונות משמעותיים על פני חומרים ביולוגיים אחרים. הידרוג PEG הוא סינטטיים, המציע רמה גבוהה של שליטה על תכונות הנדסיות כגון מודול אלסטיות וקצב הידרדרות בהשוואה לעמיתיהם ביולוגי הטבעיים שלהם ^1. כפי שהם נגזרים סינטטי, יש PEG נמוכים באופן משמעותי השתנות אצווה כדי אצווה לעומת חומרים טבעי המופקים ^מ4. בשל ההרכב הכימי של PEG, הידרוג אלה הם הידרופילי מאוד, עמידים לחלבון ספיחה, וביולוגי ^3. התנגדות זו לחלבון ספיחה מאפשרת הידרוג PEG לפעול כ 'לוח חלק', המאפשר לחוקרים לחקור וללמוד את גורמים ספציפיים ביולוגיים או כימיים (סמים, ביומולקולות, פפטידים הידבקות תא, וכו ') ואת התפקידים הספציפיים פקטו אלהrs לשחק בשליטה סלולרי ו / או רקמת התנהגות.

לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 1: דוגמאות של פולי (אתילן גליקול) ארכיטקטורות (PEG) PEG 4 זרוע) לינארי PEG ב ') עם pentaerythritol ליבת PEG 8 הזרוע C) עם ליבת hexaglycerol PEG 8 זרוע D) עם…. tripentaerythritol ליבה. n הוא המספר של PEG חוזר על כל זרוע. לכל אחד יש לחזור על משקל מולקולרי של 44 g / mol, ולכן n ניתן לחשב את המשקל המולקולרי הכללי ו# מבנה / זרוע.

מבשרי PEG זמינים עם מגוון רחב של ארכיטקטורות ומשקלים מולקולריים (איור 1 ). שינוי הארכיטקטורה (# זרוע) וחוזר אתילן גליקול (n) של PEG יכול לשמש כדי לשלוט במאפיינים של רשתות הידרוג'ל נוצרו מmacromers אלה. ללא שינוי PEG מכיל קבוצות הידרוקסיל מסוף אשר חייב להיות מוחלפת עם פונקציונליות חלופית כדי להקל על crosslinking קוולנטיים באמצעות polymerizations, בדרך כלל מועסק על אסטרטגית crosslinking להידרוג PEG, לפני היווצרותם של רשתות הידרוג'ל. יש מגוון של קבוצות כימיות אשר יכול להיות משולבת בתוך macromers PEG כדי להקל פילמור וcrosslinking רשת (acrylate, methacrylate, אתר ויניל, norbornene, וכו '). למרות מגוון רחב של פונקציות מסוף זמינות כדי להקל על crosslinking, יש רק שני מנגנונים שבאמצעותם פילמור יכול להתרחש: צעד ושרשרת צמיחה (או תערובת של שני מצבים מעורבים,).

"Width =" g2.jpg "/> 600px
לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

תוצאות פילמור סכמטי רשת הידרוג'ל תיאורטית) את התוצאות מסורתיות שרשרת צמיחה פילמור ברשתות הטרוגניות המכילות פולי הצפופים (מ) crosslinking אזורים וnonidealities רשת מוגברת כגון לולאות, מבשרי unreacted, והסתבכויות קבועות ב ') שלב צמיחה ב: איור 2.. מבני רשת באופן משמעותי יותר הומוגנית (לא בקנה מידה).

פונקציות שcrosslink באמצעות פילמור בשרשרת הצמיחה אינה דורשות הנוכחות של crosslinker נוסף. עם זאת, הידרוג-polymerized שרשרת לייצר מבני רשת הטרוגנית המכילים אזורי crosslinking הצפופים (איור 2 א) ^1. לעומת זאת, requi פילמור שלב צמיחהמיל שימוש crosslinker או עמיתים למונומר שהוא מגיב עם הקבוצות פונקציונליות המסוף של macromers PEG. כקבוצות פונקציונליות מסוף על PEG יכולות להגיב רק עם crosslinker וcrosslinker יכול להגיב רק עם הקבוצות פונקציונליות מסוף על PEG, זה תוצאות בהומוגניות מבנה רשת גדולה יותר (איור 2) ^1. polymerizations שלב הצמיחה גם בדרך כלל להוביל להמרה גבוהה יותר של קבוצות פונקציונליות, להקטין את הכמות של מבשרי unreacted ופוטנציאל לתגובות חיסוניים / דלקתיות עקב macromers מסיס, שאינם מאורגנים ^1. שיטות פילמור מצב מעורב גם פותחו המשלבות את שני פילמור צעד ושרשרת הצמיחה באמצעות שימוש בmacromers שיכול גם לעצמי להגיב (שרשרת צמיחה) ומגיב עם crosslinker (שלב צמיחה). זה מייצר הידרוג עם מאפיינים של כל מנגנון פילמור, וניתן להשתמש בם כדי לייצר מבני רשת מורכבים יותר, מגוונים יותר אוצעד או רשתות בשרשרת צמיחה לבד ^1.

אמנם יש שפע של קבוצות פונקציונליות אשר יכול לשמש לfunctionalize PEG ולאפשר היווצרות הידרוג'ל, methacrylates וnorbornenes כמה moieties פילמור בשרשרת ושלב גידול הנפוץ ביותר, בהתאמה. שתי הפונקציות הללו מציעים שליטת spatiotemporal מצוינת על פילמור רשת, וכאשר משתמשים בו כדי לתמצת תאים, רשתות אלו תומכות שרידות תא הכוללות גבוהות ^5-7. Dimethacrylate Crosslink פונקציונליות PEG (PEGDM) באמצעות פילמור שרשרת ומאפשר שילוב של ביומולקולות או גורמים אחרים באמצעות שיתוף פילמור עם acrylate, ביומולקולות methacrylate-, או באופן דומה פונקציונליות ^5,6. יש לי הידרוג PEGDM יתרונות משמעותיים על פני מערכות פילמור חלופיות בשרשרת צמיחה כגון PEG acrylate פונקציונליות (PEGDA). שימוש בשיטות מסורתיות, יכול להיות מסונתז PEGDA מהירות רבה יותר מאשר PEGDM; הוwever, באמצעות סינתזה בסיוע מיקרוגל, סינתזת PEGDM הוא אפילו יותר יעיל. PEGDA לעתים קרובות מסונתז ^ב8 או 24 שעות ⁹ תגובות בן לילה, אבל יכול גם להיות מסונתז בארבע שעות בטמפרטורות גבוהות ^10. PEGDM גם מסונתז באופן מסורתי על ידי מגיב ¹¹ לילה או ל24 שעות ^5, עם כמה שיטות הארכת זמן התגובה עד 4 ימים ^12. תוך שימוש בשיטה בסיוע המיקרוגל הפגינה כאן, יכול להיות מיוצר PEGDM בתגובת 5 דקות. אמנם יש PEGDM קינטיקה תגובה איטית יותר מאשר ¹³ PEGDA, תגובת crosslinking לPEGDM היא עדיין מהירה, המתרחשת בתוך דקות, ומשיגה המרת macromer גדולה מPEGDA כהידרופוביות המוגברת של קבוצת methacrylate מגביר צבירת קבוצה פונקציונלית בפתרון, ובכך להגדיל את ההסתברות של העברה רדיקלית והמרת methacrylate ^14. הידרוג PEGDM קשור גם עם כדאיות מוגברת סלולרית וצמיחה כפילעומת הידרוג PEGDA, ככל הנראה בשל הירידה בקצב תגובה בכל זמן נתון, מה שמפחית את ריכוז קיצוני וmacromers unreacted הווה ^14. polymerizations תיאול-ene כגון אלה באמצעות הידרוג צורת PEG (PEGN) פונקציונליות norbornene באמצעות פילמור שלב צמיחה, ודורש שימוש בPEGN וcrosslinker שמכיל בממוצע של יותר משתי קבוצות פונקציונליות. מאז thiyl רדיקלים מגיבים עם אג"ח norbornene פחמן פחמן כפול, crosslinkers רב תיאול המכילה משמש בדרך כלל כדי crosslink הידרוג PEGN, המאפשר שילוב קליל של פפטידים עם פונקציות חומצות אמינו ציסטאין ^7. אמנם יש תהליכים כימיים רבים אחרים אשר מגיבים באמצעות פילמור שלב צמיחה (תגובות מיכאל-בנוסף כגון תיאול-acrylate ¹⁵ וsulfone תיאול-יניל ¹⁶ ", לחצו על" תגובות כגון ¹⁷ וכו alkyne-אזיד), הידרוג תיאול-norbornene הוא נפוץ מאוד, כמו המתח מטבעת norbornene מגבירה באופן משמעותי את קצב התגובה ומקטינה את הסיכוי של פילמור השרשרת כפולה אג"ח עובר אותה norbornene ^7.

ההחלטה בין methacrylate, norbornene, או functionalization החלופי כדי להקל על היווצרות הידרוג'ל מבוססת במידה רבה על הגישה. לדוגמא, רשתות PEGDM polymerized שרשרת צמיחה הוכחו כמתאים גם לשלוט לוקליזציה תא בפיתוח של ^18,19 periosteum רקמות מהונדסות. רשתות PEG שלב צמיחה polymerized מתאימות יותר עבור השילוב של רצפי פפטיד כדי להקל השפלה הידרוג'ל enzymatically מגיבה, בשל הקלות של שילוב של רצפי מצע אנזים באמצעות תיאול (ציסטאין) המכיל פפטידים וnorbornene macromers פונקציונליות ^20. אם שאלת המחקר יטופל בצורה הטובה ביותר את השימוש של הידרוג שלב צמיחה, פיירבנקס et al. מספק תיאור מפורט של norborאסטרטגית functionalization הננה ^ל7 PEG. יפרט במאמר זה איך יכולים להיות פונקציונליות PEG ורצפי פפטיד (עם methacrylate לPEG, וmethacrylamide לפפטידים) לתגובות פילמור השרשרת.

באופן מסורתי, PEGDM מיוצר על ידי מגיב PEG עם כלוריד methacryloyl וtriethylamine בdichloromethane. התגובה מותרת להתקדם בלילה טמפרטורת חדר ¹¹ או ל24 שעות ^5, עם כמה שיטות הארכת זמן תגובה עד 4 ימים ¹² לפני סינון, ממטרים באתר diethyl, וגבייה. בעוד וריאציות רבות של גישה זו קיימות, כולם זמן רב, דורשים מגוון רחב של ציוד סינתזה כימית, ואינם ידידותיים לסביבה, כפי שהם כרוכים בשימוש בכמויות גדולות יחסית של חומרים כימיים טוהר גבוה וממס. כדי לעקוף את המגבלות האלה, לין-Gibson et al. פיתח, שיטת ממס ללא סיוע מיקרוגל כדי functionalize PEG עם te קבוצות methacrylate rminal (איור 3 א) ^12. בתגובה זו, קבוצות אלכוהול המסוף של PEG מגיבות עם אחד מאטומי קרבוניל של אנהידריד methacrylic כדי ליצור carboxyl. זה מייצר את מוצר PEGDM, עם חומצת methacrylic כמוצר לוואי. יש סינתזה זו רבות מהיתרונות האופייניים של סינתזת מיקרוגל, כוללים זמן תגובה מופחתת ושיטות סינתזת ממס ללא ^21. סינתזת המיקרוגל עדיפה על השיטות שנדונו בעבר כפי שהוא באופן משמעותי מהר יותר, דורשת ציוד פחות נרחב סינתזה (למשל כלי זכוכית, צלחות תגובה), ומשתמשת בפחות מגיב כוללת וכמויות ממס כממסים נדרשים רק לטיהור מוצר / אוסף ולא עבור סינתזה, מה שהופך את זה יותר חסכוני וידידותי לסביבה.

0px "/>
לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3:. שרטוטי Functionalization) פולי (אתילן גליקול) הוא הגיב עם 10x אנהידריד methacrylic העודף טוחנת לייצר פולי (מאתילן גליקול) ב ') באותה שיטה זו יכולה לשמש לfunctionalize N-הסופית של רצפי פפטיד, ויצרו. methacrylamide פפטיד פונקציונליות. על ידי ביצוע הליך זה לפני ביקוע פפטיד מהשרף, functionalization סלקטיבית של N-סופית יכול להתבצע כקבוצות צד חומצת אמינו יישארו מוגנות. n: מספר PEG חוזר בmacromer (n = 45.5, 227 ו455, בהתאמה, עבור 2, 10, ו20 kDa יניארי PEG בשימוש). R1 לRN: צד חומצת שרשרות אמינו. PG1 לPGN: שרשרת בצד הגנה על קבוצות. TFA: חומצת trifluoroacetic. טיפים: triisopropylsilane. DODT: 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol. H ₂ O: מים.

שיטת methacrylation בסיוע המיקרוגל הותאמה לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו functionalize את N-הסופית של פפטידים עם קבוצות methacrylamide (איור 3 ב) כדי להקל על שילוב פפטיד למגוון רחב של פולימרים ורשתות פולימריות. בתגובה זו, אמין העיקרית של N-הסופית של הפפטיד מגיב עם אטום קרבוניל באנהידריד methacrylic כדי ליצור אמיד. זה יוצר את הפפטיד פונקציונליות methacrylamide, עם חומצת methacrylic מיוצרת כמוצר לוואי. בעת השימוש בהליך זה כדי functionalize N-הסופית של רצפי פפטיד, חשוב שחומצות אמינו המכילות שרשרות צד תגובתי (אמינים ראשוניים (ליזין), אלכוהול (סרין, תראונין) ופנולים (טירוזין)) מוגנים בfunctionalization, ו קבוצות הגנה הם ביקע רק לאחר התאגדות methacrylamide.

מאמר זה ידגים שני מיקרוגלים, אלהave בסיוע שיטות לסנתז PEGDM וfunctionalize רצפי פפטיד על השרף, המדגיש מלכודות נפוצות ומציע שיטות לפתרון בעיות. במאמר זה, שיטות לביצוע טכניקות כימיות אנליטיות הנפוצה המועסקות להעריך functionalization המוצר שיפורטו, והצעות ומשאבים לביצוע שינויים מתקדמים יותר יינתנו. תוצאות אופייניות תהיה הפגינו הכוללות שימוש בPEGDM המסונתזת ליצירת רשתות הידרוג'ל מנצל הידרוג נוצר כדי לשלוט בשחרורו של תרופת מודל, והעסקת פפטידים פונקציונליות כדי להקל על אינטראקציות תא הידרוג'ל. תשומת לב מיוחדת שישולם לאפיון גודל רשת הידרוג'ל ודן כיצד הרכב הידרוג'ל יכול להיות מכוון להשפיע על נכס זה היסוד פיזי, אשר בתורו שולט תכונות חומר בתפזורת כגון קשיחות ולפרופיל שחרור תרופה.

Protocol

1. סינתזה בסיוע מיקרוגל של PEGDM על מנת למנוע זיהום במים, טרום היבש כל כלי הזכוכית בשימוש בתנור (> 60 מעלות צלזיוס) במשך שעה 1. הערה: כלי זכוכית נדרשים כוללת: שתי כוסות 100-מיליליטר, כוס 250 מיליליטר, 3 מריות, בקבוק יכנר 250 מיליליטר, משפך ביכנר 7 סנטימטר, זכוכית שעון 10-סנטימטר. אתר טרום צמרמורת 100-150 מיליליטר נטול מים diethyl (74.12 g / mol) לממטרים שבוצעו לאחר מכן בשלב 1.6 על ידי שפיכתו לתוך כוס, מכסה את הכוס עם זכוכית שעון, והצבת הכוס לתוך צלחת גיבוש מחדש מלא בקרח. הזז מיקרוגל וvortexer למנדף כימי. הערה: דיאתיל אתר יכול להיות גם prechilled ידי הנחת הכוס במקפיא כימי. טמפרטורת האתר הנמוכה diethyl מושגת על ידי מצמרר במקפיא תהיה להגביר את קצב והיעילות של משקעים. בסירה לשקול קטנה, לשקול את 5 גרם של פולי (אתילן גליקול) (PEG) של molecuמשקל lar על פי בחירתך (1,000-100,000 דא). אם קיימים, להסיר את חתיכת הפלסטיק מהמכסה של בקבוקון הנצנץ. הטרה הבקבוקון, ולוותר 10 עודפים טוחנת של אנהידריד methacrylic לתוך הבקבוקון (MA, 154.16 g / mol) למשוואה 1 במכסת המנוע. הוספת PEG לבקבוקון הנצנץ. (1) איפה היא המסה של PEG בגרם, הוא המשקל המולקולרי של PEG בg / mol, הוא מספר קבוצות OH מסוף על PEG, ו הוא molecuמשקל lar של תואר שני בg / mol. באופן רופף לסובב את הכובע על בקבוקון הנצנץ. הגדר את המיקרוגל ל -5 דקות על כוח מרבי. לבישת כפפות עמידה בחום, להסיר את הבקבוקון מהמיקרוגל כל 30 שניות. מלא להדק את הכובע ומערבולת 30 שניות. חזור על פעולה עד הפתרון כבר במיקרוגל במשך 5 דקות המלאה. הכובע עשוי צריך להיות מוחלף במהלך ההליך בשל פיצוח. עם הכובע משוחרר, בואו PEGDM להתקרר לטמפרטורת חדר. ממיסים את PEGDM בכמות קטנה (10-15 מיליליטר) של dichloromethane (DCM, 84.93 g / mol). הערה: מומלץ שיורשה PEGDM כדי לקרר באופן משמעותי (~ 5 דקות) לפני תוספת DCM, כדי למנוע רתיחה של DCM (קרצינוגן חשד) עקב חום שיורי. PEGDM יכול להיות שבור לחתיכות קטנות בעזרת מרית וvortexed כדי לסייע בפירוק. משקע PEGDM ב10x אתר diethyl עודף קר כקרח ל20 דקות. הערה: ייתכן שיהיה צורך scratch צד הכוס עם מרית ליזום היווצרות גבישים כדי לזרז יתדות נמוכות משקל מולקולרי (2,500 דא), עם זאת, PEG עם משקל מולקולרי נמוך 1,000 דה ולא לזרז למרות גירוד. שימוש במשפך ביכנר ובקבוק, לאסוף PEGDM ידי סינון ואקום. אל תסננו כדי להשלים יובש, כמו זה יהיה לקדם את ספיחת מים לPEGDM. הערה: במידת צורך למערכת ואקום מסוימת בשימוש, מלכודת ואקום יכולה להיות ממוקמת בין התקנת הסינון ומקור הוואקום כדי להגן על משאבת הוואקום מנזק על ידי אדי חומר. העבר PEGDM המסונן לצינור חרוטי 50 מיליליטר עם מחט מד גדול פלח את הכובע לאוורור. אחסן את הלילה בתא ואקום לייבוש. Redissolve PEGDM בDCM וreprecipitate (כמו בשלבים 1.5-1.7) כצעד אחרון כדי להסיר MA unreacted. ייבש שוב כמו בשלב 1.8. 2. אפיון של PEGDM Functionalization שימוש בכלורופורם deuterated (120.38 g / mol) כממס, הכנת דגימות ל1 H-NMR. הנח מדגם קטן של PEGDM (10 ≈ מ"ג) בבקבוקון נצנץ עם כמות קטנה של הממס (1.0 ≈ מיליליטר). ריכוז היעד הוא 10 מ"ג / מיליליטר. לאחר המדגם נמס, להעביר אותו לצינור NMR נקי. המדגם צריך למלא את 4-5 סנטימטר החלק התחתון של צינור NMR. אסוף את ספקטרום NMR הפרוטון. הנתונים שלנו נאספים באמצעות ספקטרומטר 400 MHz. הפעל דגימות בטמפרטורת חדר למשך לפחות 64 סריקות כדי להשיג רזולוציה מספיק נתונים. אם ניתוח NMR (איור 4) מציין functionalization PEGDM הוא פחות מ 90%, יש לחזור על הליך methacrylation. התאם את המסה של תואר שני בשימוש כדי להסביר את הכמות מופחתת של PEG unfunctionalized. הערה: אחוזים מPEG פונקציונליות לתוך PEGDM ניתן לחשב מנצפו: יחס תיאורטי של methacr מסוףפרוטוני ylate (a, b ו-c) לפרוטונים PEG המרכזיים (איור 4) (ד). לPEG ליניארי, המספר התיאורטי של פרוטוני PEG המרכזיים מחושב על ידי משוואה 2: (2) איפה הוא המשקל המולקולרי של PEG בg / mol ו הוא המשקל המולקולרי של חוזר אחת PEG (44 g / mol). לPEG קוי, משוואה זו חייבת להיות שונה כדי לשקף את מבנה הסתעפות הספציפי (איור 1). Functionalization אחוזים אז יכול להיות מחושב באמצעות משוואה 3: (3) איפה <img alt="משוואה 3.1" fo:content-width="30px" src = "/ files/ftp_upload/50890/50890eq3.1.jpg" width = "40px" /> הוא האזור שנצפה תחת ד שיא (δ = 6.63 עמודים לדקה), הוא האזור נצפה תחת פסגות פרוטון methacrylate (, δ = 1.94 עמודים לדקה; B ו-C, δ = 5.57 ו6.12 עמודים לדקה), ו הוא המספר התיאורטי של פרוטוני methacrylate (= 3 * , B = 1 * וג = 1 * – 6, 2 ו -2 בהתאמה לPEG ליניארי). חישוב functionalization אחוזים צריך להתבצע באמצעות פסגות, B ו-C בנפרד, ולאחר מכן בסיס ממוצעאד להשיג functionalization אחוזים כולל. הערה: PEGDM מספיקים פונקציונליות אז יכול להיות dialyzed (במים, נגד מים) ונאסף על ידי lyophilization להסיר אנהידריד methacrylic שייר וחומצת methacrylic. המוצר הסופי צריך להיות מעורבב עם כמות קטנה (0.01% WT) של מעכבי כגון חומצת לימון או ויטמין C ומאוחסן עם יבוש ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. מוצר PEGDM הסופי יכול לשמש לייצור הידרוג, כמפורט במאמר יופיטר ידי Khetan ו22 Burdick. 3. Functionalization בסיוע מיקרוגל של פפטידים על השרף הערה: פפטידים שלנו מסונתזים באמצעות שרף Fmoc-גלאי-ואנג, באמצעות סינתיסייזר פפטיד אוטומטי עם ניטור קרינת UV, ופתרונות 0.2 M חומצת אמינו בN-methylpyrrolidone (NMP, 99.1 g / mol). piperazine 5% (86.1 g / mol) בdimethylformamide (DMF, 73.1 g / mol) משמש לdeprotection, 0.5 M O-benzotriazole-N, N, N ', N'-tetramethyl-uronium-hexafl uoro פוספט (HBTU, 379.3 g / mol) בDMF משמש כמפעיל, ו2 M diisopropylethylamine (DIEA, 129.3 g / mol) בתמ"א משמש כבסיס activator. יכולים גם להיות מושגת פפטידים מן הספק פפטיד מסחרי. בעת שימוש במקורות מסחריים זה קריטי, כי פפטידים נרכשים על שרף עם שרשרת צד חומצת אמינו הגנה על קבוצות שלמות ולא ביקע באופן מלא, כפי שהוא רגיל. הערה: חשוב שכל חומצות אמינו עם שרשרות צד תגובתי מוגנות כדי להבטיח שfunctionalization methacrylamide מתרחש רק באמינים הראשוניים של N-הסופית של הרצף. ראה לוח 1 לחומצות אמינו עם קבוצות בצד תגובתי, וקבוצות הגנה טיפוסיות. חומצות אמינו עם קבוצות הגנה ישולבו ברצף במהלך סינתזת פפטיד באותו אופן כמו חומצות אמינו nonprotected, והם זמינים לעתים קרובות מהספקים חומצת אמינו זהים. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502"> חומצת אמינו קבוצה תגובתי הגנה על קבוצה ליזין אמין יסודי טרט-butyloxycarbonyl (בוק) סרין אלכוהול עיקרי טרט בוטיל (TBU) תראונין אלכוהול המשני TBU טירוזין פנול TBU טבלת 1: חומצות אמינו הריאקטיבי וקבוצות הגנה טיפוסיות. לסנתז פפטידים באמצעות סינתזת פפטיד שלב מוצק סטנדרטית, ולאחסן על שרף על 4 מעלות צלזיוס בDMF עד מוכן לשימוש. שימוש במשפך ביכנר 7 סנטימטר בנייר מסנן ובקבוק 250 מיליליטר, לאסוף את שרף פפטיד מDMF באמצעות סינון. אם קיים להסיר את חתיכת הפלסטיק מהמכסה של בקבוקון הנצנץ. להעביר את השרף לבקבוקון הנצנץ. בעזרת פיפטה חד פעמית, להוסיף מספיק רק תואר שני כדי לכסות את השרף בבקבוקון הנצנץ. באופן רופף למקם את הכובע על בקבוקון הנצנץ. הגדר את המיקרוגל ל -3 דקות על כוח מרבי. לבישת כפפות עמידות בחום, להסיר את הבקבוקון מהמיקרוגל כל שניות 15-20. מלא להדק את הכובע ומערבולת 15 שניות. חזור על פעולה עד הפתרון כבר במיקרוגל לפוll 3 דקות. עם הכובע משוחרר, בואו פתרון פפטיד להתקרר לטמפרטורת חדר. שימוש בכמות קטנה של DMF ומשפך ביכנר עם נייר סינון ובקבוק, לאסוף את שרף פפטיד מהבקבוקון. העבר את שרף פפטיד לבקבוקון נצנץ טרי ולבקע וdeprotect פפטיד. ל0.25 מילימול של שרף, אנו משתמשים בתגובה בטמפרטורת חדר 2 שעות עם סיבוב, תוך שימוש בקוקטייל מחשוף של 18.5 מיליליטר חומצת trifluoroacetic (TFA, 114.02 g / mol) עם 0.5 מיליליטר כל אחד מtriisopropylsilane (TIPS, 158.36 g / mol), 3,6-Dioxa-1 ,8-octanedithiol (DODT, 182.30 g / mol) וdeionized מים (18.02 g / mol). הערה: קוקטייל זה מספיק עבור רוב הפפטידים, אבל לא deprotect-sulfonyl 2,2,4,6,7-pentamethyl-dihydrobenzofuran-5 חומצות (PBF) מוגנת אמינו (בדרך כלל משמשות להגנה על שרשרות צד ארגינין). אם הרצף מכיל כל קבוצות מוגנת PBF, 0.5 מיליליטר של TFA צריך להיות מוחלף עם 0.5 מיליליטר thioanisole (124.20 g / mol) ומחשוף הזמן עלה ל 4 שעות. הערה: אם מעונן צורות חומר גבישים, בקוקטייל המחשוף, פפטיד הוא צפוי להתרסק מפתרון ואת עוצמת הקול של קוקטייל המחשוף צריך להיות מוכפל. צ'יל 400 אתר diethyl נטול מים מיליליטר על קרח בכוס מכוסה בזכוכית שעון. לזרז את הפפטיד ב10x אתר diethyl עודף, ולחלק את הפתרון באופן שווה בין ארבעה צינורות 50 חרוטי מיליליטר. צנטריפוגה ב XG 3,200 10 דקות כדי לאסוף את הפפטיד. למזוג את האתר, ו resuspend פפטיד ב100 מיליליטר אתר diethyl טרי מחולק בין שני צינורות חרוטי 50 מ '. חזור על תהליך צנטריפוגה, resuspending ב50 מיליליטר של אתר טרי פעמיים בסכום כולל של 4 שטיפות אתר. הערה: הפעולה זו מסירה את הכימיקלים המשמשים בקוקטייל המחשוף ובקעה הגנה על קבוצות מפפטיד המוצק. לאחר שלב צנטריפוגה האחרון, למזוג et הפסולתשלה ולייבש את הפפטיד לילה תחת ואקום. 4. אפיון של פפטיד Functionalization השתמש 50:50 H 2 O: אצטוניטריל (41.05 g / mol) + 0.1% TFA כממס לניתוח MALDI-TOF של דגימות פפטיד. הנח מדגם קטן (2 – 1 מ"ג) של הפפטיד בצינור Eppendorf 1.5 מיליליטר ולפזר את הדגימה ב 1 מיליליטר של ממס MALDI. הכן את פתרון המטריצה. חומצת מטריצה בדרך כלל מועסקים היא α-Cyano-4-hydroxycinnamic (CHCA, 189.2 g / mol) כמטריצה. ממיסים 10 מטריצת מ"ג / מיליליטר בממס MALDI, ויצר פתרון מטריצת מניות. הערה: פתרון מניות מטריקס ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר למשך עד שבוע לניתוח נוסף. מערבבים את הפפטיד ופתרון מטריצת ביחס של 1:1. ספוט פתרון משולב זה על שלושה מקומות נפרדים על צלחת מדגם MALDI, והוסיף μl 1 / במקום. ייבש את הכתמים, או על ידי ייבוש באוויר או באמצעות אקדח חום. Respot ויבש כלמדגם. הערה: Respotting מייצר מדגם פפטיד / מטריצה אחידה יותר, ומסייע בקבלת איתות ברורה. גם תמהיל פפטיד סטנדרטי צריך להיות משולב עם פתרון מטריצת ביחס של 1:1 והבחין (רק פעם אחת) על גבי צלחת MALDI. לאסוף את נתוני MALDI-TOF. בשל התוספת של קבוצת methacrylamide לN-הסופית של הפפטיד, לא אמור להיות עליית 68 g / mol במשקל מולקולרי מעל זה של המשקל המולקולרי פפטיד לבד. הערה: שלא כמו בסינתזת PEGDM, לא ניתן refunctionalized פפטידים, כמו על מחשוף קבוצות הגנה על חומצות אמינו עם שרשרות צד תגובתי יוסרו, וfunctionalization סלקטיבית של N-Termini כבר לא יכול להיות מובטח. אם MALDI הניתוח (איור 5) מציין את הפפטיד היה פונקציונליות בצורה נכונה וכל קבוצות ההגנה ביקע כראוי, פפטיד ניתן dialyzed (במים, נגד מים) ונאסף על ידי lyophilization לremovדואר מזהמים שיורי (קוקטייל מחשוף, אתר, ביקע הגנה על קבוצות וכו '). פפטיד המוצק יש להעביר צינור Eppendorf קטן ומאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

Representative Results

תהודה מגנטית גרעינית פרוטון היא אחת טכניקות אנליטיות הנפוצות ביותר על מנת להעריך את היעילות של תגובה כימית, כפי שהאזור מתחת לכל שיא ספקטרום הוא מידתי לרמות היחסית של פרוטון שבמדגם, המאפשר קביעת היחסים של מוצר ומגיב במדגם. לתגובה זו, 1 ניתוח H-NMR (איור 4) ניתן להשתמש בו כדי לחשב את functionalization% מנצפו: יחס תיאורטי של פרוטוני methacrylate מסוף (a, b ו-c) לפרוטונים PEG מרכזיים (ד). PEGDM מוצג באיור 4 היה 2,000 Da לפני functionalization, ולכן n = 2,000 דא / (44 חוזר דא / PEG) = 45.5, אז ד = 4 * (n-1) = 178, מה שהופך את הפרוטון: יחס יחידת NMR 178 / 102.16 = 1.74. במקרה זה, לשיא שלא ניתן להשתמש בם בהערכת functionalization%, כפי שהנוכחות של מים במדגם באופן מלאכותי מגדילה את השטח מתחת לשיא. השימוש ב שיא, functionalization% הוא 1.00 * 1.74 / 2 * 100% = 87.1%; מנצליםg ג שיא, functionalization% הוא 1.08 * 1.74 / 2 * 100% = 94.1%. לכן, functionalization% הכולל הוא 91% וPEGDM זה הוא פונקציונליות במידה מספקת לשימוש בסינתזת הידרוג'ל. בדרך כלל, functionalization כ 90% מושגת לאחר סבב methacrylation אחת. בשל ריבוי של פסגות פרוטון המתעוררות ב1 ניתוח H-NMR של פפטידים, functionalization פפטיד הוא נחקר בקלות רבה יותר באמצעות ספקטרומטר מסת MALDI-TOF. זו באה לידי הביטוי באיור 5, שבו GKRGDSG פפטיד היה מסונתז ונתון methacrylamide functionalization. חלק קטן של הפפטיד היה ביקע עבור prefunctionalization הערכת משקל מולקולרי (איור 5 א), אשר הראתה את שיא המשקל המולקולרי שנצפה מתרחש ב676 g / mol, המשקל המולקולרי הצפוי של פפטיד, המצביע על סינתזה נכונה של הרצף הפפטיד. שארית הפפטיד עברה methacrylamide פונקציונליתנפלת על קרקע פורה לפני המחשוף. כפפטיד זה מכיל PBF מוגן חומצות אמין R, המחשוף בוצע בקוקטייל המכיל thioanisole במשך 4 שעות. לאחר functionalization methacrylamide, שיא המשקל המולקולרי שנצפה מתרחש ב744 g / mol (איור 5), המשקל הצפוי של פפטיד methacrylamide פונקציונליות (676 +68 g / mol) ולא במשקל המולקולרי הצפוי של פפטיד unfunctionalized, המציין נכון functionalization. כדי להדגים את הפונקציונליות של שניהם PEG ופפטיד methacrylamide פונקציונליות, הידרוג PEGDM יוצרו עם ובלי 0.5 מ"מ methacrylamide פונקציונליות GKRGDSG (איור 6). הידרוג יוצרו עם 10% WT 10 kDa PEGDM יניארי ב-PBS, עם 0.05% WT פניל-2 ליתיום ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) כphotoinitiator. הפתרון המבשר הידרוג'ל הוזרק בין שתי שקופיות זכוכית מופרדת על ידי spacer שקופיות זכוכית והחזיקו יחד עם קליפים קלסר. פתרון מבשר שלאחר מכן נחשף לאור UV 365 ננומטר ב2 mW / 2 סנטימטר עבור 10 דקות כדי לגרום crosslinking, לאחר שג'לי בקוטר 8 מ"מ נאספו באמצעות אגרוף גלילי. ג'לי היו שטוף בPBS ואיפשר להתנפח למשך 2 ימים כדי להבטיח תנאי נפיחות שיווי משקל הושגו 16,20. MSCs אדם (קטע 3) גדל לconfluency 80% וזורע על הידרוג ב15,000 תאים / 2 סנטימטר. התאים הורשו לדבוק ל48 שעות לפני שהועבר לתקשורת טריות המכילה 0.5 μl / מיליליטר calcein AM וμl / מיליליטר ethidium homodimer 2 (ערכת LIVE / DEAD הכדאיות מן Invitrogen) וצלמתי מתחת ניגוד שלב וקרינה ב10X הגדלת שימוש ניקון Eclipse Ti 2000. MSCs לא הצליחו לדבוק בהידרוג unfunctionalized PEG (איור 6 א), אלא על הכללת RGD פפטיד הידבקות התא הם היו מסוגלים לדבוק והתפשטו על פני השטח הידרוג'ל (איור 6). תמונות חיות / DEADהוצג אינו מייצג את יכולת הקיום של אוכלוסיית MSC זרע, כMSCs הם תאי הידבקות תלויה שלהתנתק ממשטח ג'ל עם מוות ויוסרו במהלך תהליך העברת תקשורת, וכתוצאה מכך האינפלציה מלאכותית של כדאיות תא זרע. במקום זאת, תמונות הניאון נועדו לסמן בין תאים חסיד ושינויים קטנים בטופולוגיה הידרוג'ל, אשר יכול להיות קשה תחת בניגוד שלב לבד. באופן מעניין, תאי nonspread זורעים על ג'לי PEG רק כתם חיובי עבור שניהם AM calcein וhomodimer ethidium, מצביעים על כך שהתאים מתים בזמן ההדמיה. אחד היתרונות הרבים להידרוג PEG הוא הטבע מתכונן מאוד שלהם. שינוי האיפור הספציפי של הידרוג'ל PEG מאפשר חוקרים רמה גבוהה של שליטה על מאפיינים כגון מודול אלסטיות. כפי שמודגם באיור 7, שניהם במשקל מולקולרי PEG (איור 7 א) ואחוז המשקל ( <stronאיור 7) ידועים g> כדי לשלוט בגודל הידרוג'ל רשת (ξ) וקשיחות הידרוג'ל תוצאה ולשחרר שיעור של תרופות במארז. זה הודגם על ידי הפקת הידרוג עם PEGDM משקל מולקולרי שונה, וחוקר את מודול תוצאת הידרוג'ל וגודל רשת (איור 8). כל הידרוג יוצרו עם 10 WT% PEGDM ליניארית ב-PBS, עם LAP 0.05% WT כphotoinitiator. 40 μl של פתרון מבשר הידרוג'ל היה ב 1 מיליליטר מזרקים עם הטיפים מנותקים, ונחשף ל365 UV ננומטר אור ב2 mW / 2 סנטימטר עבור 10 דקות כדי ליצור הידרוג, לייצר גיאומטריות גליליות כ 5 מ"מ בקוטר 2 מ"מ בגובה . ג'לים הורשו להתנפח PBS במשך 2 ימים לפני בדיקות מכאניות. מודולוס הידרוג'ל נקבע באמצעות QT MTS / 5 עם 5 N תא עומס תוך דחיסה בין 5 ל 10% מגובה הידרוג'ל ראשוני בשיעור של 0.1 מ"מ / שנייה. לאחר בדיקה מכאנית הושלמה, גודל רשת נקבע על ידי מדידת mas הידרוג'לים מראש (ים M) ולאחר (ז ד) 24 שעות של lyophilization באמצעות משוואת פלורי-Rehner כמפורט בפרק הדיון, עם חישובים שבוצעו בMATLAB. כהשערה, להגדיל את המשקל המולקולרי של PEG macromer גרם לעלייה בגודל רשת הידרוג'ל (איור 8 א) וירידה בהידרוג'ל נוקשות (איור 8 ב). גודל רשת הידרוג'ל ונוקשות ג'ל תוצאה גם יכולים להיות נשלטו על ידי שינוי אחוז משקל PEG. הידרוג יוצרו עם WT% משתנים של יניארי 10 kDa PEGDM, וקשיחות הידרוג'ל וגודל רשת נקבעו כמתואר (איור 9) בעבר. כפי שהומחש באיור 7, הגדלת WT% PEG גורם לירידה משמעותית בגודל רשת (איור 9 א) ועלייה בהידרוג'ל נוקשות (איור 9 ב). הידרוג המכיל אלבומין במארז סרום שור (BSA) נוצרו באמצעות molecula משתנהr PEG משקל (2, 10, ו20 KDA). כל הידרוג יוצרו עם PEGDM 10 WT% בPBS המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטר BSA, כפי שתואר באיור 6. ג'ל הודגרו ב 1 מיליליטר PBS על 37 מעלות צלזיוס, והועבר לPBS הטרי בכל נקודת זמן. BSA פורסם היה לכמת באמצעות assay ברדפורד מThermo Scientific. גודל רשת הידרוג'ל נקבע כאמור לאיור 8. כפי שמודגם באיור 7 א, שחרור BSA מתרחש במהירות רבה יותר מהידרוג נוצר באמצעות PEGDM משקל המולקולרי גבוה יותר, כתוצאה מגודל הרשת הגדולה יותר בתוך הידרוג'ל (איור 10). איור 4. 1 H-NMR הנציג של 2 kDa יניארי PEGDM פונקציונליות תוך שימוש בשיטה בסיוע המיקרוגל. Functionalization אחוזים יכול להיות ca lculated מבוסס על ציין:. יחס תיאורטי של פרוטוני methacrylate מסוף (a, b ו-c) לפרוטונים PEG המרכזיים (ד) לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 5. MALDI-TOF נציג GKRGDSG פפטיד () לפני (ב ') לאחר functionalization תוך שימוש בשיטה בסיוע המיקרוגל. שימו לב ששיא המשקל המולקולרי נצפה לאחר functionalization מתרחש ב744 g / mol, המשקל הצפוי של פפטיד methacrylamide פונקציונליות (676 +68 G / mol) ולא במשקל המולקולרי הצפוי של פפטיד פונקציונליות של האו"ם (676 g / mol). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "תמיד"> איור 6. לעומת זאת נציג שלב (משמאל) וLIVE / DEAD (ירוק / אדום) תמונות ניאון (מימין) של MSCs תרבית על ג'לי) PEG לבד ו-B) ג'לי המכיל PEG 0.5 מ"מ methacrylamide GKRGDSG פונקציונליות. MSCs אינו מסוגלים לדבוק ולהתפשט על ג'לי PEGDA לבד, אלא על שילוב של RGD פפטיד הידבקות תא, מסוגל לדבוק והתפשטו על פני השטח הידרוג'ל. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 7. א) PEG אחוז במשקל במשקל מולקולרי PEG ו-B) המשמש ליצירת רשתות הידרוג'ל משפיע על גודל רשת הידרוג'ל (_8 ;) וקשיחות הידרוג'ל תוצאה ולשחרר שיעור של תרופות במארז.) הגדלת משקל מולקולרי PEG (משמאל לימין) באחוז משקל הקבוע מגדילה את גודל רשת הידרוג'ל, הפחתת הידרוג'ל נוקשות ולהגדיל את קצב שחרור תרופה. ב ') הפחתה במשקל האחוז של PEG (משמאל לימין) משמש ליצירת הידרוג מגדיל גודל רשת הידרוג'ל, באופן דומה הפחתת הידרוג'ל נוקשות והגברת קצב שחרור תרופה (לא בקנה מידה). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 8. א) מגדילה גודל Mesh ו-B) הידרוג'ל קשיחות יורדת עם הגדלת משקל מולקולרי של macromer PEG. N = 10 ברים שגיאה, = SEM, *** p &60 #; 0.001 ידי כיוון אחד ANOVA עם מבחן post hoc-HSD של Tukey. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות פריזמה 5. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 9. א) Mesh ירידות גודל ו-B) עליות נוקשות הידרוג'ל עם PEG WT% גובר. N = 9-10, ברים שגיאה = SEM, ** p <0.01, *** p <0.001 ידי בכיוון אחד ANOVA עם HSD של Tukey פוסט מבחן הוק. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 10. שחרורו של encaשחרור BSA אלבומין מודל psulated שור תרופה בסרום (BSA) מהידרוג נוצר באמצעות 2 kDa, 10 kDa, 20 משקל מולקולרי PEG kDa. מתרחש במהירות רבה יותר מהידרוג נוצר באמצעות משקל מולקולרי PEGDM גבוה יותר, כתוצאה מגודל הרשת הגדולה יותר בתוך הידרוג'ל . n = 6, ברים שגיאה = SEM. BSA% שוחרר הוא שונה באופן משמעותי (p <0.0001) בין כל שלוש הקבוצות בכל נקודה מלבד t = 1 ו2.5 שעה כאשר השחרור מ2 ו10 ג'לי kDa הם שווה ערך, על ידי דו כיוונית חוזרים-אמצעי ANOVA עם Bonferroni זמן פוסט הוק מבחן. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

השיטות מאוירות בעבר הם לא יסולא בפז לסינתזה של PEGDM וfunctionalization methacrylamide של פפטידים או תרכובות המכילים אמין אחרות. חומרים אלו יכולים לשמש לרפואה רגנרטיבית ויישומי משלוח סמים. בשל האופי הידרופילי של PEG, יש לי הידרוג נוצר מmacromers PEG תכולת מים גבוהה דומה לרקמות רבות בגוף, ^2. איכות זה עושה PEG עמיד מאוד לחלבון ספיחה ולכן אינרטי בגוף ^3. עם זאת, אופי hygroscopic של PEG יכול להוכיח בעייתי במהלך functionalization. אם מים הוא בהווה במדגם PEG במהלך הליך methacrylation, אנהידריד methacrylic יגיב מעדיף עם מים ליצירת חומצת methacrylic, וfunctionalization העני של PEG יגרום.

לכן, אחד הצעדים החשובים ביותר שניתן לנקוט כדי להבטיח methacrylation המוצלח של PEG או הפפטיד הוא לשמור אלמימתנאי תגובת ראוז. הצעד המומלץ של ייבוש כל כלי הזכוכית לפני השימוש נועד על מנת למנוע זיהום מים. הנוכחות של מים במדגם ניתן לראות בניתוח NMR, כשיא רחב ב1.7 עמודים לדקה (איור 4). אם methacrylation העני הוא ציין גם לאחר ייבוש כל כלי הזכוכית, כימיקלים עלולים להיות מיובשים על נתרן גופרתי או סוכנים אחרים ייבוש (מסננות מולקולריות וכו ') לפני השימוש. גם זיקוק יכול לשמש כדי להסיר מים ולטהר אנהידריד methacrylic לפני השימוש, וזיקוק azeotropic יכול לשמש לייבוש PEG ^23. במקרים קיצוניים, סינתזה יכולה להתבצע בתא כפפות כדי להמשיך להבטיח תנאים נאותים נטול מים. סיבוב שני של methacrylation, בעקבות אותו ההליך, יכול להתבצע גם כדי להגדיל את functionalization. כי תמיד יש סיכוי שסיבובים נוספים של functionalization יידרשו, יש להיזהר בשלב 1.7 ו1.9 לאסוף במהירות PEGDM ידי סינון ואקום. סינון אבק למשך זמן ארוך יותר הוא חשיפת עליות הכרחית של PEG לאוויר, להגדיל את ההזדמנות לספיחת מים.

למרות עודף אחוזים מאנהידריד methacrylic לקבוצות פונקציונליות הידרוקסיל נותר ללא שינוי, הגדלת functionalization PEG (לדוגמא # זרוע) על מבשר PEG מזוהה בדרך כלל עם ירידה בfunctionalization אחוזים השיגה (תוצאות לא פורסמו, מעבדה בנואה). כדי לתת מענה להפחתה זו ביעילות functionalization מנע, או אם קשיים מסוימים הם נתקלו השגת גבוהה מספיק functionalization, משך הזמן של תגובת המיקרוגל עשוי להיות מוגבר, ובלבד שמרווח המיקרוגל נשמר 30 שניות. בעוד 10 עודף טוחנת הוא בדרך כלל מספיק, הסכום של אנהידריד methacrylic משמש בתגובה יכול גם להיות מוגבר כדי להגדיל את functionalization אחוזים השיג ^12.

חשוב כיצעד נוסף ממטרים (1.9) ניתן לבצע כדי להשיג את אותות תמ"ג טובים. למרות שזה מפתה לבצע הממטרים השני באותו היום כמו סינתזה, ייבוש מדגם הלילה לפני reprecipitating כבר נמצא לסייע הסרת אנהידריד methacrylic העודף וחומצת methacrylic. הכנת מדגם היא גם חשובה להשגת ספקטרום NMR נקי, ולכן דגימות צריכה להיות מוכנים באמצעות תנאים מומלצים. איור 4 מדגימה תוצאות H-NMR נציג ¹ לPEGDM פונקציונליות בצורה נכונה. על ידי ניתוח היחס של פרוטוני methacrylate מסוף לפרוטונים PEG מרכזיים, PEGDM היה נחוש להיות פונקציונליות במידה מספקת. הכנת מדגם MALDI היא חשובה באופן דומה להשגת קריאה ברורה. MALDI הוא רגיש במיוחד לנוכחותם של מלחים וריכוזים גבוהים לדוגמא. אם MALDI ברור לקרוא (בעוצמה מעל 50 יחידות שרירותיות (au) עם אות גבוהה: יחס רעש) לא ניתן להשיג, של המדגםolution צריך להיות מדולל 1:100 בממס MALDI לפני ששילוב עם פתרון המטריצה והניתוח מחודש. איור 5 מדגים תוצאות MALDI-TOF נציג אחרי functionalization הנכון פפטיד, מחשוף, והכנת מדגם. מחשוף של מדגם קטן של שרף לפני functionalization (איור 5 א) מראה סינתזה נכונה של GKRGDSG פפטיד, עם functionalization methacrylamide הנכון של פפטיד שמוצג באיור 5.

בעוד functionalization של פפטידים על השרף הוא הליך יחסית חזק, תנאי המחשוף הנדרשים עבור כל רצף לעתים קרובות דורש כוונון. לרצפים ארוכים שבו חומצות אמינו רבות לי מוגנות רשתות בצד (> 30 חומצות אמינו ארוכים, או> 15 חומצות אמינו עם הגנה על קבוצות), משך המחשוף צריך להיות מוגבר על ידי שעה אחת. עם זאת, אם זמן מחשוף מורחב יותר מדי, קשר פפטידי מחשוף עלול לגרום עקב חשיפת חומצי לטווח ארוך. MALDI ana תמוגה יכולה להיות מאוד מועילה בחושפת את כל שגיאות שהתרחשו בסינתזת פפטיד או מחשוף. ירידה שנצפתה בהמשך משקולות מולקולריות צפויות יכולה להצביע כי חומצת אמינו (ים) לא עשתה כמו שצריך בני זוג, או שהתרחשה חלוקה הפפטיד (ראה טבלה 2 למקורות של שינויים שנצפה במשקל מולקולרי). אם המשקל המולקולרי שנצפה הוא גבוה מהצפוי על ידי המשקל של קבוצת הגנה משמשת, סביר להניח שהמחשוף וdeprotection לא היה מספק ופפטיד יש recleaved לזמן נוסף.

x; "> שינוי MW (g / mol) <סגנון TD = "width: 64px;"> +24 DTH: 64px; "> -113 03px; "> Pro "Style =" 20 גובה: 20px; רוחב: 103px; "> Tyr

חומצת אמינו מחיקה	שינוי MW (g / mol)	קבוצות הגנת Uncleaved	יונים נפוצים הווה	שינוי MW (g / mol)
עלא	-71	אצטיל	+42	Cl ^–	+35
Arg	-158	Allyl	+40	K ⁺	+39
ASN	-114	Alloc	+85	Mg ^{2 +}
אפעה	-115	בוק	+100	Na ⁺	+23
Cys	-103	Fmoc	223
Gln	-128	OtBu	+56
Glu	-129	PBF	252
גלאי	-57	TBU	+56
שלו	-137	TRT	242
איל	-113
Leu
ליס	-128
נפגש	-131
Phe	-147
-97
Ser	-87
Thr	-101
TRP	-186
-147
Val	-99

טבלה 2. שנצפה שינויים במשקל מולקולרי פפטיד.

Macromers מיוצר תוך שימוש בשיטות methacrylation בסיוע מיקרוגל ניתן להשתמש במספר של רפואת רגנרטיבית או יישומי משלוח סמים. פפטידים פונקציונליות וPEGDM מסונתז גם כאן ניתן לשלב פולימרים באמצעות Nitroxide בתיווך פלמור (NMP), העברת Atom הרדיקלי פילמור (ATRP) או Addi הפיךשיטות העברת tion-פיצול (רפסודה) ^24. יכולות גם להיות מיוצרות רשתות הידרוג'ל בנוכחות של תאים, כפי שהוכיחו בעבר במאמר יופיטר ידי Khetan ^ו22 Burdick. זה בדרך כלל דורש שילוב של פפטידים הידבקות תא כגון RGD או מולקולות מטריצה תאית, כמו PEG לבדו אינו מספק אינטראקציות תא חומר קריטיות להישרדות ותפקוד של כמה סוגי תאים ^25. פפטידים, למשל, יכולים להיות מסונתזים באמצעות סינתזת פפטיד מוצק שלב מסורתי ופונקציונליים כפי שתוארו כאן, כדי לאפשר שילוב לתוך רשתות הידרוג'ל. כפי שניתן לראות באיור 6, ההכללה של פפטיד הידבקות תא פונקציונליות methacrylamide GK rgds G בהידרוג (0.5 מ"מ) מאפשר הידבקות של תאים אנושיים גזע mesenchymal (MSCs) למשטחי הידרוג'ל PEG, הגדלת מספר המצורף ותאים מתפשטים (איור 6 ), בהשוואה ל PEG הידרוג ללא פפטיד הידבקות תא ( <strאונג> איור 6 א). עם זאת, מחקרים קודמים הוכיחו כי אינטראקציות תא מהותית משופרות נוסף על ידי הכללתם של 3,400 מפרידי דה PEG בין פפטידים דבק ורשתות הידרוג'ל, כדי להפחית את הפרעה סטרית פפטיד-integrin. ללא הכללת spacer, תאים עשויים ליצור אינטראקציה עם הידרוג PEG באמצעות חלבונים ספציפיים שסופחים לפפטיד, ולא באמצעות אינטראקציות בתיווך integrin עם פפטידים ^26. לשלב spacer PEG זה ולהימנע מאינטראקציות ספציפיות, יכולים להיות מצומדת פפטידים לmonofunctionalized PEG באמצעות N-הופעל hydroxysuccinimidyl אסטרים, כפי שתואר על ידי הרן וHubbell ^26.

יישומים של רשתות הידרוג'ל דורשים פיקוח הדוק על תכונות חומר. יתרון משמעותי להידרוג PEG הוא רמה גבוהה של שליטה על נכסים אלה. למשל, המשקל המולקולרי, זרוע מספר, ו% WT של PEG השתמשו במבנה של רשתות הידרוג'ל ניתן לשנות לקנוס-tunמאפיינים אלקטרוניים עבור יישומים ספציפיים. זה מאפשר פיקוח הדוק על גודל רשת הידרוג'ל (ξ), אשר שולט יחס הידרוג'ל נפיחות (Q) וקשיחות (מודול אלסטיות, E). זו באה לידי ביטוי באיור 7 א ולכמת באיור 8, בהם הגדלת תוצאות במשקל PEG macromer מולקולריות בגידול בגודל רשת הידרוג'ל (איור 8 א) וירידה בהידרוג'ל נוקשות (איור 8 ב).

המאפיין הפיזי הבסיסי ששולט בהתנהגות בתפזורת ברשתות הידרוג'ל אלה, גודל רשת, מחושב באמצעות משוואת פלורי-Rehner ^16. כדי לבצע חישוב זה, יחס נפיחות הנפחית (Q) מחושב ראשון ממשוואה 4:
(4)

בי ρ _s הוא צפיפות של מים (1 גרם / מיליליטר), _{עמ 'ρ} הוא צפיפות של PEG (1.12 גר '/ מיליליטר), M _ים היא מסה נפוחה של הידרוג'ל וM _D הוא מסה יבשה של הידרוג'ל (נמדד לעתים קרובות לאחר ההקפאה וlyophilization של הידרוג). המשקל המולקולרי בין crosslinks (ז _ג, ב g / mol) מחושב אז ממשוואה 5:
(5)

שבו מ _נ הוא MW מספר הממוצע של PEG (בg / mol), הוא נפח המסוים של הפולימר , V ₁ הוא הנפח טוחנת של מים (18 מיליליטר / mol), ₂ V הוא שבריר פולימר שיווי משקל הנפח של הידרוג'ל
( ), ו-X ₁ </תת> הוא פרמטר פולימר ממס האינטראקציה לPEG ומים (0.426) ^16. מספר הקשרים בין crosslinks (n) אז הוא מחושב ממשוואה 6:
(6)

כאשר N _b הוא מספר הקשרים בחוזרים PEG (3) _וr M הוא MW של חוזר PEG (44 g / mol) ^27. זה מאפשר את המרחק מקצה לקצה שורש ממוצע רבוע של שרשרת הפולימר (בננומטר), שיחושב ממשוואה 7:
(7)

כאשר L הוא האורך הממוצע האג"ח (0.146 ננומטר, המחושב על בסיס CC ו-CO אג"ח אורכים) _וn C הוא היחס האופייני של הפולימר (4.0 עבור PEG) ^28. FiNally, גודל רשת של הידרוג'ל ניתן לחשב ממשוואה 8:
(8)

באופן דומה יכולים להיות מכוון על ידי התאמת מאפייני הידרוג'ל הסכום של PEG השתמש במבנה של הידרוג. הקטנת אחוז במשקל של תוצאות macromer PEG בעלייה בגודל רשת הידרוג'ל, אשר לאחר מכן מפחית את נוקשות הידרוג'ל. איור 7 ממחיש והאיור 9 מכמת את אחוז המשקל של PEG משמש בהיווצרות הידרוג'ל ניתן להשתמש כדי לשלוט בגודל רשת (איור 9 א) ונוקשות כתוצאה הידרוג'ל (איור 9 ב). כמצע נוקשות הוכח להשפיע התנהגויות תאים כגון תאי גזע התמיינות ^29, היכולת לשלוט בחוזקה נוקשות היא מאפיין חשוב בייצור הידרוג'ל.

גם הידרוג ניתן להשתמש כדי contrמשלוח הסמים ol. כפי שמודגם באיור 7 א והפגין באיור 10, להגדיל את המשקל המולקולרי של macromers PEG מגדיל גודל רשת של רשת הידרוג'ל, לאחר מכן להגדיל את שחרורו של תרופת מודל במארז, אלבומין בסרום שור (BSA). בעוד דגימות הידרוג'ל במחקר זה נהרסו בזמן t = 195 שעות, כדי לאפשר מדידה של המונים רטובים ויבשים הידרוג'ל לחישובי גודל רשת, זה הניסיון שלנו, שהמשיך לשחרר BSA היה להתרחש שהדגימות שטופחו במשך תקופות זמן ארוכות יותר. המהדורה שלמה של BSA נצפתה באיור 10 היא לא בלתי צפויה, כפי שקבוצות אחרות יש גם דיווחו כי ארגון ה-BSA היא עמיד לדיפוזיה בתוך רשתות הידרוג'ל PEG ^30. שחרור חלקי של חלבון Encapsulated יכול להתרחש עקב קשרי מימן בין חלבונים וmacromers PEG, או קשר הקוולנטי בין קבוצת methacrylate על PEG וקבוצות האמינים עיקריות על שאריות ליזין ^{ביום 31 בBSA} </sעד>. בנוסף, ארגון ה-BSA נוטה צבירה ודיסולפיד היווצרות קשר לאורך זמן, אשר יכול להגביר את סטוקס הרדיוס האפקטיבי שלה ולעכב את שחרורו מהידרוג. כהידרוג שרשרת גידול, כגון הידרוג PEGDM אלה, נוטה nonidealities רשת וגודל רשת הידרוג'ל הטרוגנית (איור 2 א), אפשר גם שכל חלק של ארגון ה-BSA במארז כלול באזורים של הידרוג'ל שיש להם רשת קטנה יותר באופן משמעותי גודל מהממוצע הכללי בג'ל, ומונע השחרור שלה. אמנם שחרורו לא שלם, nonFickian (מידע לא מוצג) של ארגון ה-BSA במארז נצפה במקרה זה, שחרור Fickian המבוקר של תרופות רבות אחרות מודל, כוללים אינסולין וovalbumin, הודגם באמצעות PEGDM דומה הידרוג ^30. בנוסף, ווטקינס וAnseth השתמשו במיקרוסקופ לייזר confocal הסריקה להפגין כי שחרורו של מולקולות ניאון מהידרוג דומה הוא מודל מקובל בדיפוזיה Fickianthods ^32.

בעוד הידרוג נוצר במחקר זה הוא nondegradable, השפלה רשת היא פרמטר נוסף שניתן לשלב ומכוון ברשתות אלה. מתן לשפלת הידרוג'ל מבוקר יכול לגרום לשינויים בהתנהגות תא ^33, קידום צמיחת רקמה או ingrowth רקמה המארח, או ביטול של הצורך בexplantation ^34. הידרוג מתכלה PEG מסונתזים בדרך כלל על ידי טבעת פתיחה ד hydrolytically מתכלה, L-lactide, glycolide, או קבוצות ε-caprolactone על קבוצות הידרוקסיל בתוך PEG לפני methacrylation ^35. שלוש קבוצות אלה לבזות ידי הידרוליזה של פונקציות אסתר, עם אסטרים glycolide שיש הרגישות הגדולה ביותר לשפלה, ואחריו lactide, ואסתר caprolactone, בשל הידרופוביות המשתנה שלהם. לאחר ההתאגדות של קבוצות hydrolytically מתכלים, PEG יכול להיות פונקציונליות נוסף באמצעות detaile הליך methacrylationד במאמר זה, המאפשר היווצרות של רשתות הידרוג'ל באמצעות פילמור שרשרת יזם הרדיקלי הבא ^36,37. קצב הפירוק של רשתות הידרוג'ל יכול להיות נשלט על ידי שינוי זהותה של קבוצת hydrolytically מתכלה (glycolide, lactide, וכו ') ועל ידי שינוי מספר החזרות מתכלים התאגדו ^ב35,38 המבנה.

באופן תיאורטי, השיטות הפגינו כאן יוכל לשמש עבור acrylation של PEG ופפטידים על ידי החלפת אנהידריד methacrylic עם אנהידריד אקריליק בצעדי 1.3 ו3.3, בהתאמה. עם זאת, אנהידריד אקריליק הוא יותר מ 20 פעמים את העלות של אנהידריד methacrylic ^39,40, מה שהופך acrylation בסיוע המיקרוגל באופן משמעותי פחות אטרקטיבי מאשר methacrylation בסיוע המיקרוגל.

אנחנו הוכיחו שיטה פשוטה, מהירה לfunctionalize PEG ופפטידים, כיצד להעריך את היעילות של הליך זה, ובהתחשב במשאבים עבור uלשיר את החומרים מסונתזים ליצירת רשתות הידרוג'ל. כלים סינטטיים אלה הם מגוונים מאוד ביישומים שלהם, וצריכים להוכיח את המרכיב עיקרי בכל מספר של מעבדות מחקר משלוח הסמים וחומרים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה בחלקו על ידי מענק הווארד יוז Med-ל- גראד (AVH), על ידי סטארט כספים הניתנים לד"ר דניאל בנואה מאוניברסיטת רוצ'סטר ואורתופדי המחקר וחינוך הקרן / השתלות השלד והשרירים הקרן (עורף / MTF). המחברים מבקשים להודות לד"ר ג'יימס ל מקגראת' לשימוש בציוד שלו.

Materials

3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol	Tokyo Chemical Industry Co, LTD	D2649	CAS 14970-87-7
Acetonitrile	J.T. Baker	UN1648	CAS 75-05-8
Amino Acids	AAPPTech	Glycine: AFG101	CAS 29022-11-5
		Arginine: AFR105	CAS 154445-77-9
		Asparagine: AFD105	CAS 71989-14-5
		Serine: AFS105	CAS 71989-33-8
Anhydrous diethyl ether	Fisher Scientific	UN1155	CAS 60-29-7
Citric acid	Sigma Aldrich	C1857	CAS 77-92-9
Deuterated chloroform	Cambridge Isotope Laboratories Inc.	DLM-7-100	CAS 865-49-6
Dichloromethane	Fisher Scientific	UN1593	CAS 75-09-2
Diisopropylethylamine	Alfa Aesar	A1181	CAS 7087-68-5
Dimethylformamide	Fisher Scientific	D119-4	CAS 68-12-2
Fmoc-Gly-Wang resin	Peptides International	RGF-1301-PI	100-200 mesh size
Methacrylic anhydride	Alfa Aesar	L14357	CAS 760-93-0
N-Methylpyrrolidone	VWR	BDH1141-4LG	CAS 872-80-4
On-resin peptides	Synthesized in-house		On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate	AnaSpec Inc	510/791-9560	CAS 94790-37-1
Peptide Calibration Standard	Care	206195
Piperazine	Alfa Aesar	A15019	CAS 11-85-0
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear	Alfa Aesar	B22181	CAS 25322-68-3
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear	Alfa Aesar	B21955
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear	Sigma Aldrich	81300	JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG
Thioanisole	Alfa Aesar	L5464	CAS 100-68-5
Trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	A12198	CAS 76-05-1
Triisopropylsilane	Alfa Aesar	L09585	CAS 6485-79-6
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Tokyo Chemical Industry Co, LTD	C1768	CAS 28166-41-8

References

Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG Hydrogels for the Controlled Release of Biomolecules in Regenerative Medicine. Pharm. Res. 26, 631-643 (2009).
Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Eng. 13, 2369-2385 (2007).
Peppas, N. A., Hilt, J. Z., Khademhosseini, A., Langer, R. Hydrogels in biology and medicine: From molecular principles to bionanotechnology. Adv. Mater. 18, 1345-1360 (2006).
Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat. Biotechnol. 23, 47-55 (2005).
Benoit, D. S., Durney, A. R., Anseth, K. S. The effect of heparin-functionalized PEG hydrogels on three-dimensional human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Biomaterials. 28, 66-77 (2007).
Benoit, D. S., Collins, S. D., Anseth, K. S. Multifunctional hydrogels that promote osteogenic human mesenchymal stem cell differentiation through stimulation and sequestering of bone morphogenic protein 2. Adv. Funct. Mater. 17, 2085-2093 (2007).
Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of Poly(Ethylene Glycol) Diacrylate Hydrogels with Biomolecules to Regulate and Guide Endothelial Morphogenesis. Tissue Eng. A. 15, 579-585 (2009).
Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23, 4315-4323 (2002).
Yanez-Soto, B., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Biochemically and topographically engineered poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomimetic characteristics as substrates for human corneal epithelial cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 101A, 1184-1194 (2013).
Benoit, D. S. W., Anseth, K. S. Heparin functionalized PEG gels that modulate protein adsorption for hMSC adhesion and differentiation. Acta Biomater. 1, 461-470 (2005).
Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).
Anseth, K. S., Wang, C. M., Bowman, C. N. Reaction Behavior and Kinetic Constants for Photopolymerizations of Multi(Meth)Acrylate Monomers. Polymer. 35 (94), 3243-3250 (1994).
Bencherif, S. A., et al. End-group effects on the properties of PEG-co-PGA hydrogels. Acta Biomater. 5, 1872-1883 (1016).
Rydholm, A. E., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Degradable thiol-acrylate photopolymers: polymerization and degradation behavior of an in situ forming biomaterial. Biomaterials. 26, 4495-4506 (2005).
Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol) Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and Mechanical Properties. Biomacromolecules. 11, 1348-1357 (2010).
Malkoch, M., et al. Synthesis of well-defined hydrogel networks using Click chemistry. Chem. Commun. , 2774-2776 (2006).
Hoffman, M. D., Benoit, D. S. Emerging Ideas: Engineering the Periosteum: Revitalizing Allografts by Mimicking Autograft. , (2012).
Hoffman, M. D., Xie, C., Zhang, X., Benoit, D. S. The effect of mesenchymal stem cells delivered via hydrogel-based tissue engineered periosteum on bone allograft healing. Biomaterials. , (2013).
Hubbell, J. A., Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N. Cell-responsive synthetic hydrogels. Adv. Mater. 15, 888-892 (2003).
Lidstrom, P., Tierney, J., Wathey, B., Westman, J. Microwave assisted organic synthesis – a review. Tetrahedron. 57, 9225-9283 (2001).
Khetan, S., Burdick, J. Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering. J. Vis. Exp. (32), e1590 (2009).
Antonios, M., Kurtis, K., Lucas, K. Drying poly(ethylene glycol). Nat. Protoc. Exchange. , (2012).
Nicolas, J., Mantovani, G., Haddleton, D. M. Living radical polymerization as a tool for the synthesis of polymer-protein/peptide bioconjugates. Macromol. Rapid Comm. 28, 1083-1111 (2007).
Nuttelman, C. R., Benoit, D. S. W., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. The effect of ethylene glycol methacrylate phosphate in PEG hydrogels on mineralization and viability of encapsulated hMSCs. Biomaterials. 27, 1377-1386 (2006).
Hern, D. L., Hubbell, J. A. Incorporation of adhesion peptides into nonadhesive hydrogels useful for tissue resurfacing. J. Biomed. Mater. Res. 39, 266-276 (1998).
Andreopoulos, F. M., Beckman, E. J., Russell, A. J. Light-induced tailoring of PEG-hydrogel properties. Biomaterials. 19, 1343-1352 (1998).
Merrill, E. W., Dennison, K. A., Sung, C. Partitioning and Diffusion of Solutes in Hydrogels of Poly(Ethylene Oxide). Biomaterials. 14, 1117-1126 (1993).
Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. J. Biomed. Mater. Res. A. 90A, 720-729 (2009).
Mellott, M. B., Searcy, K., Pishko, M. V. Release of protein from highly cross-linked hydrogels of poly(ethylene glycol) diacrylate fabricated by UV polymerization. Biomaterials. 22, 929-941 (2001).
Watkins, A. W., Anseth, K. S. Investigation of molecular transport and distributions in poly(ethylene glycol) hydrogels with confocal laser scanning microscopy. Macromolecules. 38, 1326-1334 (2005).
Anseth, K. S., Benoit, D. S. W., Durney, A. R. Manipulations in hydrogel degradation behavior enhance osteoblast function and mineralized tissue formation. Tissue Eng. 12, 1663-1673 (2006).
Hillwest, J. L., et al. Prevention of Postoperative Adhesions in the Rat by in-Situ Photopolymerization of Bioresorbable Hydrogel Barriers. Obstet. Gynecol. 83, 59-64 (1994).
Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Hubbell, J. A. Bioerodible Hydrogels Based on Photopolymerized Poly(Ethylene Glycol)-Co-Poly(Alpha-Hydroxy Acid) Diacrylate Macromers. Macromolecules. 26, 581-587 (1993).
Skaalure, S. C., Milligan, I. L., Bryant, S. J. Age impacts extracellular matrix metabolism in chondrocytes encapsulated in degradable hydrogels. Biomed. Mater. 7, 024111-0210 (2012).
Hoffman, M. D., Benoit, D. S. Agonism of Wnt-beta-catenin signalling promotes mesenchymal stem cell (MSC) expansion. J. Tissue. Eng. Regen. Med. , (2013).
Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Vanrensburg, J. J., Dunn, R. C., Hubbell, J. A. Optimization of Photopolymerized Bioerodible Hydrogel Properties for Adhesion Prevention. J. Biomed. Mater. Res. 28, 831-838 (1994).
. Methacrylic Anhydride [Internet] Available from: https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=AAAL14357-18 (2013)

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Van Hove, A. H., Wilson, B. D., Benoit, D. S. W. Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation. J. Vis. Exp. (80), e50890, doi:10.3791/50890 (2013).