Verwendung von pHluorin zur Bewertung der Dynamik von Axon-Leitrezeptoren in der Zellkultur und im Küken-Embryo

Während ihrer Navigation integrieren Axone mehrere Umwelthinweise, die sie zu ihrem Ziel führen. Diese Hinweise aktivieren Leitrezeptoren an der Oberfläche von Axonklemmen, den Wachstumskegeln, die wiederum einen geeigneten Signalweg initiieren. Daher ist die zeitliche und räumliche Regulation der Zelloberflächenverteilung der Rezeptoren entscheidend, um die Empfindlichkeit des Wachstumskegels¹einzustellen. In diesem Zusammenhang ist die Mittellinienüberquerung durch kommissarische Axone ein ausgezeichnetes Modell, um die Regulierung der Oberflächenebenen von Rezeptorzellen zu untersuchen. Im sich entwickelnden Rückenmark werden kommissarische Axone zunächst zur ventralen Bodenplatte hin angezogen, wo sie die Mittellinie überqueren. Nach der Überquerung verlieren sie ihre Reaktionsfähigkeit auf die Bodenplatten-Anziehungsmittel und gewinnen an Reaktion auf Bodenplattenabweisende, so dass sie die Bodenplatte verlassen und in Richtung ihres Endziels in der kontralateralen Seite des Nervensystems navigieren können^2,3. Die Regulierung der Rezeptorverfügbarkeit an der Wachstumskegeloberfläche ist einer der Mechanismen, die dem Wechsel der Reaktionsfähigkeit auf Mittellinien^{hinweise 4,5}zugrunde liegen. Daher ist die selektive Überwachung der Rezeptoren, die an der Plasmamembran von Wachstumskegeln vorhanden sind, von größter Bedeutung. Wir beschreiben hier eine Methode, die auf der pH-abhängigen Fluoreszenzeigenschaft einer grünen Fluoreszenzproteinvariante (GFP) basiert, um speziell die Axon-Führungsrezeptoren zu visualisieren, die an die Plasmamembran in vitro und in vivoim sich entwickelnden Kükenrückenmark adressiert sind.

Rothman und Kollegen entwickelt durch Punktmutationen pH-sensitive Varianten von GFP einschließlich der Ekliptik pHluorin⁶. Ekliptisches pHluorin hat die Eigenschaft, nicht fluoreszierend zu sein, wenn es einem sauren pH-Wert (<6) ausgesetzt ist, während es bei neutralem pH-Wert fluoreszierend ist. Dies ermöglicht die Unterscheidung von nichtfluoreszierenden Rezeptoren, die in intrazellulären sauren Kompartimenten lokalisiert sind(d.h. Endosomen, Handelsvesikeln) von fluoreszierenden Rezeptoren, die in die Plasmamembran integriert und somit dem extrazellulären neutralen pH⁷ausgesetzt sind. Wir nutzten dies, um die Plasmamembranlokalisierung von plexinA1 zu überwachen, einem Axon-Führungsrezeptor, der die Wachstumskegelreaktion auf das Mittellinien-repellens Semaphorin 3B⁵ vermittelt (Abbildung 1A). Wir beschreiben hier die In-vitro-Charakterisierung eines pHluorin-plexinA1-Konstrukts, zusammen mit der ovo Elektroporation^8-10 dieses Konstrukts im sich entwickelnden Kükenrückenmark, gefolgt von der mikroskopischen Analyse von Kryosektionen, die es ermöglichen, die Axon-Führungsrezeptordynamik in vivo mit räumlichen und zeitlichen Auflösungen zu verfolgen.