シロイヌナズナ根重力屈性反応の高分解能時間経過画像を収集するためにフラットベッドスキャナを使用して

1。画像取得プロトコル考慮事項： 1が単独で作業することが可能であるが、このプロトコルは、最も効率的に、2人で行っている。本研究室で最高の作業の配置は、スキャナのセットアップ上の別の作品は、両方のスキャナにプレートを配置し、スキャン処理を開始するために協力しながら、スキャンのためにプレートを準備するために1人のためだった。 それがこのプロジェクトのスキャナーが垂直スキャナ背面に載っスキャナ蓋を向いていることに注意することも重要です。カスタムサポートは、この垂直位置で食器を保持するために作られたと3Mコマンドストリップ（ 図2）とフラットベッドの表面に貼り付けた。このプロトコル（エプソンV700）で使用されるスキャナに付属している取り外し可能な原稿カバーは黒のフェルトを1面に並んでました。原稿カバーはバンジーコードにしてフラットベッドに接して配置した代わりにプレートを保持し、画像コントラスト（ 図3）を提供する。 十分な解像度の任意のスキャナは、画像キャプチャを使用することができる。エプソンパーフェクV700があるため、ベッドとふたの両方からスキャンすると赤外線チャネルを使用するために、その正方形のプロファイル（それが簡単に縦に配置することになる）、その高解像度、および追加オプション選択されまし​​た。これらの追加オプションについては、このプロトコルで使用されていませんでした。 プレートを成長チャンバから除去されると、プロトコルが終了し続けることが不可欠である。 プレートの準備 透明媒質10mlと各プレートの中央を横切って植えられた種子9を含む標準のペトリ皿を使用した。 ：プレートのラベル、メディアの準備と植栽のための手順を見つけることができますhttp://www.doane.edu/doane-phytomorph <l私は>最初の寒天プレートを取得し、キムワイプで寒天プレートの蓋の蓋とリム上で収集結露を吸収する。 キムワイプで蓋にトリトンX-100（界面活性剤）を適用 – 寛大である。 （トリトンX-100は、プレートがスキャンされるように蓋に結露の蓄積を防ぐことができますので注意してください。蓋表面上に膜を作成するのに十分な寛大なアプリケーションは、（）蓋全体スキャナの実行を通して透明のままいることを確認する助けとなるでしょう。） ふたを固定するために微小孔テープでプレートをラップし、換気を可能にするために。 スキャナのセットアップと画像収集 このプロトコルは、1以上のスキャナが使用されていることを前提としており、一台のコンピュータから複数のスキャナを開始する手順を説明します。 各スキャナから画像を保存するためのフォルダを作成します。各スキャナは、二つのプレートを保持するため、フォルダを作成するときには、このことを覚えていきます。 1このようなユニークな各プレートのID、苗の年齢、種子サイズ、および植え株式のIDなどのファイル名の構成要素として、メタデータを使用することを選択するかもしれません。これらのメタデータを含むデータの収集に使用されるフ​​ォルダ名の例は、「1652から2-SM-9から92-17-1653から2-LG-88-79から161」である。 指定された収集時間のための出口タイマーを設定します（9時間、この研究室で使用された）。準備のための余分な時間（時間かそこら）を設定してください。 （VueScanをソフトウェアは、ユーザーが繰り返し画像を収集することができますが、それはユーザが収集するか、どのくらいの時間のために画像を収集する方法を多くの画像を示すことはできません。スキャナは取得時間を設定するために、コンセントのタイマーに接続する必要があることに注意してください。） 第1スキャナの電源をオンにして、その最初のウォームアップを通過するスキャナは約10秒待ちます。 一度VueScanをプログラムを開きます。 VueScanをバージョン9.0.20は（材料表を参照）、このプロトコルで使用された、しかし、より最近のバージョンは少しmodificで使用することができますATION。 「詳細」ボタンは、後述のメニューオプションを表示するために、ユーザーインターフェイスの底面に押されたことを確認してください。 オートリピートを設定します]ドロップダウンボックスをnoneに設定し、プレビュー領域Input]タブの下やクロップ ] タブの下で： 最大 （ 図4）。を押して「プレビュー」。 クリックして、プレビュー画像上で関心領域をドラッグし、マウスを使用することによって、関心領域を捕捉するトリミングボックスを作成します。設定は、 クロップ ] タブで目的の領域のために変更することができる。クロップボックスのために使用される一般的な設定であった：0.675 Xオフセット、Yオフセットこれは、各スキャナの苗の領域をキャプチャするために調整したものの、中に1.924を。使用トリミングボックスのサイズは、高さ（ 図5）で1.1で広いで7.246だった。 トリミングボックスを移動するには、マウスをドラッグしながらShiftキーを押したままにします。クロップボックスをすべてスキャンする苗プラスラベル（ 図5）に含まれている可能性があり、任意のメタデータが含まれていることを確認します。 クロップ ] タブで、[プレビュー]領域を設定します。クロップボックスとプレス「プレビュー」に。 [出力 ] タブに移動して、スキャナ用の正しいファイル（ 図5）を選択します。 繰り返しは、1台のコンピュータのためのすべてのスキャナに1.7から1.12を繰り返します。 VueScanをの複数のインスタンスを開くかどうかを尋ねられたとき「はい」オプションを選択します。 各タブを通過し、設定が正しいことを確認します。 （すべての仕様は、画像の色、解像度、 等を含む個々の研究室のニーズに合わせて変更することができることに留意されたい。しかしながら、このプロトコルで使用される設定は、パ直接に適用することができるVueScanをソフトウェアの共通のインターフェイスのために与えられた研究室のrticularスキャンウェア。 VueScanをバージョン9.0.20）を使用して、このプロジェクトで使用されるパラメータを表示するには、付属の仕様一覧を参照してください。 [Input]タブの下でオートリピートでの連続選択します。フィールドを、または必要に応じて、画像間のより長い時間間隔を選択します。時間間隔は、スキャナが最後の画像を保存し、次の画像の収集を開始した後に一時停止時間の長さである。 連続モードでは、3〜4分間の解像度4,800 dpiで得ることができる。 繰り返しは、単一のコンピュータに接続されているスキャナの残りの1.14から1.15を繰り返します。 水平に向け苗で正しいスキャナ（gravistimulateはありません）で調製したプレートを置きます。 彼らはプレキシグラステンプレートから落下しないように一時的に黒を置き、プレートに対して背景を感じました。すべてのスキャンの繰り返し純就学率。 （ 注：このプロジェクトでは、フェルトの黒い部分は、文書に添付されたまぶしさを防ぐために、ルート組織に対してコントラストを提供するために、装置に付属のカバーを使用する特定の背景色が画像化される組織の色に依存します。）。 1人は（プレートは、このプロトコルでは反時計回りになっていた）プレートを90°回転させ、すぐにフェルトの背景を交換している。 彼らはすぐに「スキャン」ボタンを押すことができるように他の人がコンピュータの前に立っている必要があります。 バンジーコード（ 図3）をスキャナに背景を固定します。 1人は別の位置バンジーコードしながら、所定の位置に背景を保持している。 （ 注：すぐgravistimulation（90°のプレートの回転）とフェルト背景を配置した後、「スキャン」を押す必要があります）。 繰り返します、単一のコンピュ上でスキャナの残りの1.17から1.21ステップER。 該当する場合を繰り返しスキャナの次のセットのための1.6から1.22を繰り返します。 いくつかの画像は、彼らが正常に保存していることを確認するために収集されるまで、スキャナを放置しないでください。 これは、指定されたスキャン時間のために乱れがないことになる領域にスキャナを維持するために理想的です。これは、理想的な表現型の応答を確実にするために、走査領域内の環境条件を考慮することも賢明である。 データ収集が完了すると、各スキャナと一致している各VueScanを窓に緑の中止ボタンを押してください。 コンピュータ上のすべてのプログラムの外に閉じます。 コンピュータを再起動し、画像収集の別のラウンドを開始する前に、すべてのスキャナを遮断してください。