Mit Flachbett-Scanner mit hoher Auflösung zeitversetzt Bilder von der Arabidopsis-Wurzel gravitropen Antwort sammeln
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur raschen Sammlung von Bildern von Arabidopsis Keimlingen Reaktion auf einen Reiz der Schwerkraft unter Verwendung von handelsüblichen Flachbettscanner. Die Methode ermöglicht kostengünstige, High-Volume-Erfassung von hochauflösenden Bildern zugänglich für Downstream-Analyse-Algorithmen.
Abstract
Die Forschungsanstrengungen in der Biologie erfordern zunehmend den Einsatz von Methoden, die High-Volume-Sammlung von hochauflösenden Daten zu ermöglichen. Eine Herausforderung Labors stehen, ist die Entwicklung und Verwirklichung dieser Methoden. Beobachtung von Phänotypen in einem Prozess von Interesse ist eine typische Ziel der Forschungslabors Studium Gen-Funktion, und dies wird oft durch Bildaufnahme erreicht. Ein besonderer Prozess, der für die Beobachtung mit bildgebenden Verfahren ist die Korrektur Wachstum von einem Sämling Wurzel, die aus der Ausrichtung mit der Schwerkraftvektor verschoben wurde. Imaging-Plattformen verwendet, um die Wurzel gravitropen Reaktion messen kann teuer, im Durchsatz relativ gering ist, und / oder arbeitsintensiv sein. Diese Fragen wurden durch die Entwicklung eines Hochdurchsatz-Bildaufnahmeverfahren mit preiswerten, aber hochauflösende, Flachbett-Scanner angesprochen. Mit dieser Methode können Bilder alle paar Minuten bei 4.800 dpi aufgezeichnet werden. Das aktuelle Setup ermöglicht Sammlung von 216 einzelnen responses pro Tag. Die gesammelten Bilddaten von reichlich Qualität für Bildanalyse.
Introduction
Sammlung von hochauflösenden phänotypischen Daten sind nützlich in Studien, die das Zusammenspiel von Genetik und Umwelt in der Vermittlung organismal Funktion 1,2 verstehen wollen. Studien dieser Art sind auch von Natur aus in großen Maßstab, so dass es zusätzlich erforderlich, dass für die Messung Phänotypen in diesem Zusammenhang angewandten Methoden in Hochdurchsatz 3,4 sein. In die Methoden zur Phenomics angelegte Forschung, Kompromisse zwischen Durchsatz und Auflösung ins Spiel kommen. Methoden, die in höheren Durchsatz sind, neigen auch zu niedrigeren Auflösung sein, so dass es schwierig ist, geringe Auswirkungen der Genetik oder der Umgebung 5 zu erfassen. Alternativ Methoden, die genauer messen einen gewünschten Phänotyp neigen auch zu niedrigeren Durchsatz, so dass es schwierig ist, genetische und Umwelteinflüsse weitgehend überblicken. Zusätzlich können manuelle Methoden zur Quantifizierung von Phänotypen, einschließlich visueller Inspektion, Veränderungen unterliegen aufgrund der Unterschiede in der menschlichen Pro6 Wahrnehmung.
Imaging-Technologien können eine nützliche Brücke zwischen Durchsatz und Auflösung bei der Beschaffung von phänotypischen Beobachtungen 9.7 bieten. Im allgemeinen ist ein Bild relativ leicht zu erfassen, zu erleichtern Durchsatz, und wenn bei ausreichender Auflösung eingenommen wird, kann feine Phänotypen erkannt werden 1,2,7. Imaging-Technologien neigen modifizierbar, um ein System oder Verfahren von Interesse fit zu sein und sind in der Regel 10-12 skalierbar. Aus diesem Grund sind ideal Imaging-Technologien für die Entwicklung von großen Studien der organismischen Funktion.
Die Reaktion der primären Wurzel zu einem Schwerkraft Stimulus ist ein kompliziertes physiologischer Prozess, der innerhalb eines morphologisch einfaches Organ auftritt. Die Antwort beinhaltet die Aktivierung der Signalwege, die durch die Wurzel Organ ausbreiten und ihr Fortschreiten durch Umwelt-und genetischen Faktoren, wie genetische Faktoren, die durch die Umwelt beeinflusst wird 12-14 </sup>. Die Reaktion der primären Wurzel zu einem Schwerpunkt Reiz hat mindestens seit Darwin studiert, aber es gibt viel zu lernen, wie es funktioniert, vor allem in den frühen Signalereignisse und in den Faktoren der Vermittlung Antwort Plastizität 12,14,15. Der Erwerb von einem detaillierten Verständnis der Dynamik dieser Antwort ist bei der Suche nach Möglichkeiten, um die Fähigkeit der Keimlinge, um erfolgreich in einer bestimmten Umgebung 16 etabliert verbessern wichtig. Darüber hinaus ist die Form des Wurzel macht es zugänglich für Bildverarbeitungsanwendungen 8,12,17. Zusammengenommen ist die Wurzel gravitropen Antwort ein ideales System für die Entwicklung von Hochdurchsatz-Imaging-Technologie für die Zwecke der Durchführung der Genomik-Level-Studien der organismischen Funktion.
In diesem Bericht wird ein Hochdurchsatz-und hochauflösende Methode zur Bildaufnahme des Wurzel gravitropen Reaktion unter Verwendung kostengünstiger, handelsüblichen Flachbettscanner vorgestellt. Die Übersicht über dieProtokoll ist in Fig. 1 gezeigt. Sämlinge gepflanzt auf Agar-Platten wurden auf vertikal ausgerichteten Flachbettscanner mit benutzerdefinierten Plexiglasplatte angebracht Halter positioniert. Die Bilder wurden alle paar Minuten bei 4.800 dpi gesammelt und auf einem lokalen Laufwerk oder Daten-Server gespeichert. Metadaten, die mit jeder Bildreihe zugeordnet ist, in einer Datenbank gespeichert, und die gespeicherten Bilder verarbeitet werden. Der Ansatz nutzt die Software VueScan für die Bilderfassung. VueScan kann verwendet werden, um mehr als 2.100 verschiedene Scanner auf Windows-, Mac-oder Linux-Betriebssystemen laufen (siehe Materialien Table) werden. Ein Scanner-Auflösung von 4.800 dpi wurde in dieser Anwendung verwendet, um die in früheren Studien mit festen CCD-Kameras 1,8,12 erreichte Auflösung entsprechen. Die Flexibilität der VueScan-Software zusammen mit der gemeinsamen Schnittstelle verwendet es für jeden Scanner läuft es ermöglicht Benutzern, ohne weiteres auf die in diesem Papier Protokoll verabschieden praktisch jede Scanner-Hardware mit ausreichender Auflösung. Stromdurchsatz ermöglicht die Sammlung von216 Einzelantworten pro Tag. Die Technologie ist anpassungsfähig und skalierbar für den Einsatz in Einrichtungen, die von Hochschulen zu Universitäten erforschen. Darüber hinaus sind die gesammelten Bilder von ausreichender Qualität für die Bildanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genaue phänotypische Beobachtung ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Erscheinungsformen der Gen-Funktion in einem Organismus. Ein Weg, um phänotypische Informationen zu erwerben, ist die Erfassung von hochauflösenden Bilddaten. Der Scanner-basierte Plattform entwickelt hat, Sammlung von vielen Bildern (200 Bilder / Scan-Zeit) mit hoher Auflösung (4800 dpi) über mehrere Stunden aktiviert. Darüber hinaus bietet diese Plattform ist leicht zu einer Vielzahl von Labor und Klassenzimmer Umgebungen aufgrund der Flexibilität der Software VueScan, Tausende von verschiedenen Scannern über eine gemeinsame Schnittstelle laufen 18 angepasst.
Die hier vorgestellte Methode füllt eine Lücke im Hochdurchsatz-Bilderfassung, die von Großanlagen Phänotypisierung und automatisierte Systeme implementierbar in einem einzigen Labor erstreckt. Die Hochdurchsatz-Plattformen verfügbar sind in der Regel spezialisierte Imaging-Hardware, einschließlich Kameras an Roboter Stützen montiert zu verwenden, um hochauflösende Bilder von p zu erfassenrimarily oberirdischen Pflanzenteile (zB Zentrum für Integrative Anlagentechnik und der Scanalyzer HTS durch LemnaTec) 20,21. Spezialisierte Bildsysteme mit Röntgen-und MRT-Technologien haben auch Bild unter der Erde Gewebe mit bemerkenswerter Auflösung entwickelt, wie sie in der Bodenumgebung (zB Zentrum für Integrative Pflanzen Technology) 11,22,23 wachsen. Diese Entwicklung von spezialisierten Technologie ist im Allgemeinen auf Kosten des Durchsatzes, so dass dynamische phänotypische Untersuchungen erschwert. Wichtig ist, dass die Kosten-und Infrastrukturbedarf für diese High-End-Plattformen machen sie meist nicht machbar für den Einsatz in kleineren Labors.
Plattformen sind ebenfalls entwickelt worden, die mehrere Standard-Bildaufnahme-Technologie und sind für die Messung der dynamischen Reaktionen wie die Wurzel Reaktion auf eine Schwerkraftreiz geeignet. Zum Beispiel wurden CCD-Kameras verwendet, um einzelne Sämling Reaktionen auf Licht und Schwerkraft bei hohen erfassenräumliche und zeitliche Auflösung 1,8,12. Andere Systeme wurden entwickelt, ermöglicht daher die Messung Wurzelspitze Ausrichtung von mehreren Wurzeln aus einem einzigen Bild (z. B. durch die RootTipMulti iPlant Collaborative) 17,24. Im ersteren Fall wird der Durchsatz relativ gering da nur ein Sämling von jeder Kamera zu einem Zeitpunkt abgebildet wird, während in dem letzteren Fall Durchsatz ist höher, aber im allgemeinen auf Kosten der Auflösung.
Die in diesem Dokument beschriebene Verfahren stellt eine Plattform für die Erfassung von hochauflösenden Bildern in hoher Durchsatz bei Ausrüstung und Software, die leicht verfügbar und relativ erschwinglich sind. Mit diesem Setup können 1.080 einzelnen Wurzel Antworten jede Woche in einem Labor mit einer Bank von sechs Scannern ausgestattet gesammelt werden. In 15 Monaten sammeln durchschnittlich 864 Einzelantworten pro Woche, wurden insgesamt 41.625 Setzlinge für eine Genomik Studie gescannt. Über 15% der einzelnen Sammlungen durch Setup-Fehler, Netzw gescheitertrk Ausfall oder Fehlfunktionen. Weitere Antworten 22% konnte aufgrund fehlender oder unzureichender Keimwurzelwachstum, eine Wachstumsreaktion hervorzurufen. Der letzte Datensatz besteht aus 27.475 einzelnen Sämling Antworten auf einen Reiz der Schwerkraft von 163 rekombinanten Inzuchtlinien sowie 99 in der Nähe von isogenen Linien. Die Daten wurden in einem Labor gesammelt, so dass dies ein sehr hoher Durchsatz-Ansatz. Auch da der für den Erwerb verwendeten Geräte ist relativ kostengünstig, zuverlässig seit über zwei Jahren auch bei intensiver Nutzung funktioniert hat.
Während dieses Protokoll ist sehr nützlich für die Forschungsziele dieser Gruppe waren, existieren einige Einschränkungen. Aufgrund der Durchsatz von 50 GB unkomprimierter Bilddaten pro Tag, war es offensichtlich, dass eine große Menge an Speicherplatz auf Haus Bilder benötigt, wenn wirksame Kompressionsverfahren entwickelt werden. Das Speicherproblem wurde vorübergehend durch den Kauf von externen Festplatten für jeden Computer gelöst. Darüber hinaus wurden zwei 10 TB Netzwerk verbundenen Speichergeräte angeschafft. Später wurden Kompressionsalgorithmen entwickelt, wie oben beschrieben, die zur Verringerung der Datenmenge um bis zu 60% (Fig. 8). Es ist wichtig zu beachten, dass die Geschwindigkeit, mit der Daten zu einem Netzwerk verbundenen Speichervorrichtung gespeichert werden kann, hängt von der Geschwindigkeit der Netzwerkverbindung. Kompressionsschemata auch auf den Wunsch, um den Verlust von Bilddaten zu verhindern eingeschränkt.
Weitere spezifische zu einem Scanner-basierten Imaging-System Einschränkungen werden auch berücksichtigt. Beispielsweise in einem Scanner-basierte Ansatz Keimlinge Licht hoher Intensität in den weißen und möglicherweise Infrarotbereich während jeder Abtastung belichtet. Dies betrifft wahrscheinlich Sämlingswachstum allerdings Keimlinge noch beobachtet robusten Reaktionen auf eine Schwerkraftreiz unterzogen (Fig. 7) werden. Eine zukünftige Verbesserung könnte beinhalten Programmierung Scanner, so dass nur Infrarot-LEDs aktiv sind. Ein Bereich, in aktiven development ist die Schaffung von Analyse-Algorithmen auch auf die Auflösung und Durchsatz dieser Bilddaten abgeglichen. Die erzeugte mit diesem Scanner-basierte Methode großen Datenmenge ist ideal für die Entwicklung von robusten Werkzeuge für die Hochdurchsatz-Phänotypisierung von Sämling Bilder. Die auf diese in Fig. 7 gezeigten Bilder verwendet Komprimierungsalgorithmus unterstützt die Behauptung, dass sie zugänglich Bildanalyseanwendungen. Zusätzlich können die erzeugten Bilder von der bisher veröffentlichten Algorithmus, RootTrace 17,24 analysiert werden, wenn sie bei geringerer Auflösung (weniger als 1.200 dpi) erhoben werden, und einzelne Setzlinge aus dem Bild unter Verwendung der oben beschriebenen Analyse vor Kompressionsalgorithmus segmentiert. Das Wurzelwachstum Daten könnten von den Bildern zu 1.200 dpi reduziert, während Spitzenwinkel Daten könnten von den Bildern zu 900 dpi (unveröffentlichte Beobachtung) reduziert extrahiert werden extrahiert werden.
Die in diesem Dokument beschriebenen Vorgehensweise passt in seine eigene Nische in der Welt der root-Bildgebung, dass es einen hohen Durchsatz und hohe Auflösung, während immer noch relativ erschwinglich. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es leicht angepasst werden, um die Imaging-Anforderungen eines bestimmten Forschungsgruppe unterzubringen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der National Science Foundation (Verleihungsnummer IOS-1031416) gefördert und wurde in Zusammenarbeit mit Nathan Miller, Logan Johnson und Edgar Spalding von der Universität von Wisconsin und Brian Bockelman, Carl Lundstedt und David Swanson von der durchgeführt worden University of Nebraska Holland Computing Center.
Materials
| Epson Perfection V700 Photo Scanners | Epson | B11B178011 | – |
| Plexiglas Scanner Template | – | – | Custom made. See Figure 2. |
| Smart Strap Bungee Cords | SmartStraps | Wal-Mart 1079478 | |
| Brinks Digital Outdoor Timers | Brinks | Wal-Mart 42-1014-2 | |
| VueScan Software | Hamrick Software | http://www.hamrick.com | |
| Segmentation Software | Chris Wentworth, Doane College | https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation | |
| 3M Micropore Tape | Fisher Scientific | 19-061-655 | – |
| Holding racks | – | – | Custom made by gluing two cookie racks together. |
References
- Miller, N. D., Brooks, T. L. D., Assadi, A. H., Spalding, E. P. Detection of a gravitropism phenotype in glutamate receptor-like 3.3 mutants of Arabidopsis thaliana using machine vision and computation. 유전학. 186, 585-593 (2010).
- Clack, N. G. Automated Tracking of Whiskers in Videos of Head Fixed Rodents. PLoS Comp. Biol. 8, (2012).
- Lussier, Y. A., Liu, Y. Computational approaches to phenotyping: high-throughput phenomics. Proc. Am. Thoracic Soc. 4, 18-25 (2007).
- Houle, D. Colloquium Paper: Numbering the hairs on our heads: The shared challenge and promise of phenomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1793-1799 (2009).
- Elwell, A. L., Gronwall, D. S., Miller, N. D., Spalding, E. P., L, T. D. B. Separating parental environment from seed size effects on next generation growth and development in Arabidopsis. Plant Cell Env. 34, 291-301 (2011).
- Silk, W. K. Quantitative Descriptions of Development. Ann. Rev. Plant Physiol. 35, 479-518 (1984).
- Cronin, C. J., Feng, Z., Schafer, W. R. Automated imaging of C. elegans behavior. Methods Mol. Biol. 351, 241-251 (2006).
- Miller, N. D., Parks, B. M., Spalding, E. P. Computer-vision analysis of seedling responses to light and gravity. Plant J. 52, 374-381 (2007).
- Iyer-Pascuzzi, A. S. Imaging and Analysis Platform for Automatic Phenotyping and Trait Ranking of Plant Root Systems. Plant Physiol. 152, 1148-1157 (2010).
- Houle, D., Mezey, J., Galpern, P., Carter, A. Automated measurement of Drosophila wings. BMC Evol. Biol. 3, 25 (2003).
- Jahnke, S. Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions. Plant J. 59, 634-644 (2009).
- Durham Brooks, T. L., Miller, N. D., Spalding, E. P. Plasticity of Arabidopsis Root Gravitropism throughout a Multidimensional Condition Space Quantified by Automated Image Analysis. Plant Physiol. 152, 206-216 (2010).
- Perrin, R. M. Gravity signal transduction in primary roots. Ann. Botany. 96, 737-743 (2005).
- Strohm, A. K., Baldwin, K. L., Masson, P. H. Molecular mechanisms of root gravity sensing and signal transduction. Dev. Biol. 1, 276-285 (2012).
- Harrison, B. R., Masson, P. H. ARL2, ARG1 and PIN3 define a gravity signal transduction pathway in root statocytes. Plant J. 53, 380-392 (2007).
- Swarup, R., Bennett, M. J., Beeckman, T. . Root Development. , 157-174 .
- French, A., Ubeda-Tomás, S., Holman, T. J., Bennett, M. J., Pridmore, T. High-throughput quantification of root growth using a novel image-analysis tool. Plant Physiol. 150, 1784-1795 (2009).
- Granier, C. PHENOPSIS, an automated platform for reproducible phenotyping of plant responses to soil water deficit in Arabidopsis thaliana permitted the identification of an accession with low sensitivity to soil water deficit. New Phytol. , 169-623 (2006).
- Walter, A. Dynamics of seedling growth acclimation towards altered light conditions can be quantified via GROWSCREEN: a setup and procedure designed for rapid optical phenotyping of different plant species. New Phytol. 174, 447-455 (2007).
- Gregory, P. J. Non-invasive imaging of roots with high resolution X-ray micro-tomography. Plant Soil. , 255-351 (2003).
- Pierret, A., Kirby, M., Moran, C. Simultaneous X-ray imaging of plant root growth and water uptake in thin-slab systems. Plant Soil. 255, 361-373 (2003).
- Naeem, A., French, A. P., Wells, D. M., Pridmore, T. P. High-throughput feature counting and measurement of roots. Bioinformatics. 27, 1337-1338 (2011).
