باستخدام ماسحات ضوئية مسطحة لجمع عالية الدقة، ساقطا التوقيت صور من Gravitropic استجابة نبات الأرابيدوبسيس الجذر
Summary
يصف هذا البروتوكول عملية لجمع السريع للصور لشتلات نبات الأرابيدوبسيس الاستجابة لحافز الجاذبية باستخدام الماسحات الضوئية المسطحة المتاحة تجاريا. يسمح أسلوب غير مكلفة، والقبض على ارتفاع حجم الصور عالية الدقة قابلة للتحليل الخوارزميات المصب.
Abstract
الجهود البحثية في علم الأحياء تتطلب بشكل متزايد استخدام المنهجيات التي تمكن مجموعة كبيرة الحجم من البيانات ذات الدقة العالية. وثمة تحد يمكن أن يواجه مختبرات هو تطوير وتحقيق هذه الأساليب. رصد الظواهر في عملية الاهتمام هو هدف نموذجي من مختبرات البحوث دراسة وظائف الجينات، وغالبا ما يتحقق ذلك من خلال التقاط الصور. عملية خاصة ان هو قابل للمراقبة باستخدام أساليب التصوير هو نمو التصحيحية من جذر الشتلة التي شردوا من المواءمة مع متجه الجاذبية. منصات التصوير المستخدمة لقياس استجابة gravitropic الجذرية يمكن أن تكون مكلفة، منخفضة نسبيا في الإنتاجية، و / أو كثيفة العمالة. وقد تم تناول هذه القضايا من خلال تطوير الإنتاجية العالية طريقة التقاط الصور باستخدام غير مكلفة، ولكن عالية الدقة، والماسحات الضوئية المسطحة. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن التقاط الصور كل بضع دقائق في 4،800 نقطة في البوصة. الإعداد الحالية يمكن جمع 216 ص الفرديةesponses يوميا. بيانات الصورة التي تم جمعها هو من نوعية وافرة لتطبيقات تحليل الصور.
Introduction
جمع البيانات المظهرية عالية الدقة مفيد في الدراسات التي تهدف إلى فهم التفاعل بين الوراثة والبيئة في التوسط العضوي وظيفة 1،2. دراسات من هذا النوع هي أيضا كبيرة بطبيعتها في نطاق واسع، مما يجعل من الضروري بالإضافة إلى أن الأساليب المستخدمة لقياس الظواهر في هذا السياق أن تكون عالية في الإنتاجية 3،4. في وضع أساليب البحث phenomics النطاق، المفاضلات بين الإنتاجية والقرار حيز اللعب. الأساليب التي هي أعلى في الإنتاجية تميل إلى أن تكون أقل في القرار، مما يجعل الأمر أكثر صعوبة للكشف عن آثار صغيرة من الوراثة أو البيئة 5. بدلا من ذلك، الأساليب التي تقيس أكثر بعناية النمط الظاهري المطلوب تميل إلى أن تكون أقل في الإنتاجية، مما يجعل من الصعب مسح التأثيرات الجينية والبيئية على نطاق واسع. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الطرق اليدوية لقياس الظواهر، بما في ذلك التفتيش البصري، وتكون خاضعة للتغيير بسبب الاختلافات في نصيب الإنسانception 6.
يمكن توفير تقنيات التصوير جسر مفيدة بين الإنتاجية والقرار في الحصول على الملاحظات المظهري 7-9. بشكل عام، وهي صورة من السهل نسبيا لالتقاط، وتسهيل الإنتاجية، وعندما تؤخذ في القرار كافية، الظواهر خفية يمكن الكشف 1،2،7. تقنيات التصوير تميل إلى أن تكون قابلة للتعديل لتناسب نظام أو عملية والفائدة هي قابلة للتطوير بشكل عام 10-12. وبسبب هذا، تقنيات التصوير هي مثالية لتطوير الدراسات على نطاق واسع من وظيفة العضوي.
استجابة الجذر الأساسي لحافز خطورة هو عملية الفسيولوجية المعقدة التي تحدث داخل جهاز بسيط شكليا. ينطوي على استجابة تفعيل مسارات الإشارات التي تنتشر من خلال الجهاز الجذر ويتم تحديد التقدم من خلال العوامل البيئية والجينية، بما في ذلك العوامل الوراثية تتأثر البيئة 12-14 </suع>. وقد تمت دراسة استجابة الجذر الأساسي لحافز الجاذبية على الأقل منذ داروين، ولكن هناك الكثير لنتعلمه عن كيفية عمله، لا سيما في الأحداث الإشارات المبكرة والعوامل التوسط في استجابة اللدونة 12،14،15. اكتساب فهم مفصل لديناميات هذا الرد مهم في إيجاد سبل لتحسين قدرة الشتلات لتصبح بنجاح المنشأة في بيئة معينة 16. بالإضافة إلى ذلك، شكل الجذر يجعل من قابلة لتطبيقات معالجة الصور 8،12،17. أخذت معا، واستجابة الجذر gravitropic هو النظام المثالي لتطوير تكنولوجيا التصوير عالية الإنتاجية لغرض إجراء دراسات على مستوى الجينوم من وظيفة العضوي.
في هذا التقرير، يتم تقديم الإنتاجية العالية، وارتفاع القرار، طريقة لالتقاط الصور من الاستجابة gravitropic الجذر باستخدام غير مكلفة، والماسحات الضوئية المسطحة المتاحة تجاريا. لمحة عامة عنويرد البروتوكول في الشكل 1. تمركزت الشتلات المزروعة على لوحات أجار على الماسحات الضوئية المسطحة الموجهة عموديا مزودة أصحاب زجاجي مخصص لوحة. وقد تم جمع الصور كل بضع دقائق على 4،800 نقطة في البوصة وحفظها على القرص المحلي أو ملقم البيانات. يتم تخزين البيانات الوصفية المرتبطة بها مع كل سلسلة صورة على قاعدة البيانات وتتم معالجة الصور المخزنة. النهج يستخدم البرنامج فويسكان لالتقاط الصور. فويسكان يمكن استخدامها لتشغيل أكثر من 2،100 الماسحات الضوئية المختلفة على ويندوز، ماك، أو أنظمة التشغيل لينكس (انظر الجدول مواد). تم استخدام الماسح الضوئي القرار من 4،800 نقطة في البوصة في هذا الطلب لتتناسب مع قرار المحرز في دراسات سابقة باستخدام الكاميرات CCD الثابتة 1،8،12. مرونة البرنامج فويسكان جنبا إلى جنب مع واجهة مشتركة لأنه يستخدم أي جهاز ماسح ضوئي تشغيله تسمح للمستخدمين اعتماد بسهولة تقريبا أي جهاز ماسح ضوئي من القرار كافية لبروتوكول المقدمة في هذه الورقة. الإنتاجية الحالية تسمح لجمع216 الاستجابات الفردية في اليوم الواحد. التكنولوجيا هي قابلة للتكيف وقابلة للاستخدام في المؤسسات بدءا من المدارس الثانوية والجامعات للبحث. وعلاوة على ذلك، فإن الصور التي تم جمعها هي من نوعية كافية لتطبيقات تحليل الصور.
Protocol
Representative Results
Discussion
الملاحظة المظهرية دقيقة أمر حاسم لفهم مظاهر وظيفة الجينات داخل الكائن الحي. طريقة واحدة للحصول على المعلومات المظهري من خلال الاستيلاء على بيانات الصور عالية الدقة. منصة القائمة على الماسح الضوئي المتقدمة مكنت من جمع العديد من الصور (200 صورة / فترة المسح الضوئي) في عالية الدقة (4،800 نقطة في البوصة) على مدى عدة ساعات. بالإضافة إلى ذلك، هذا المنبر وتتكيف بسهولة مع مجموعة متنوعة من بيئات مختبر والفصول الدراسية نظرا لمرونة البرنامج برنامج VueScan لتشغيل الآلاف من الماسحات الضوئية مختلفة باستخدام واجهة مشتركة 18.
طريقة المقدمة هنا يملأ فراغا في الإنتاجية العالية التقاط الصور التي تمتد من مرافق phenotyping على نطاق واسع والنظم الآلية للتنفيذ في مختبر واحد. منصات عالية الإنتاجية المتاحة حاليا تميل إلى استخدام أجهزة التصوير المتخصصة، بما في ذلك الكاميرات التي شنت على الدعم الروبوتية، لالتقاط صور عالية الدقة من عrimarily أعلاه الأنسجة النباتية البرية (مثل مركز النبات التكاملية التكنولوجيا وScanalyzer HTS بواسطة LemnaTec) 20،21. كما تم أيضا تطوير نظم التصوير المتخصصة باستخدام الأشعة السينية وتقنيات التصوير بالرنين المغناطيسي لالصورة أدناه الأنسجة الأرض لقرار ملحوظا، حيث أنها تنمو في بيئة التربة (مثل مركز النبات التكاملية التكنولوجيا) 11،22،23. هذا التطور من التكنولوجيا أكثر تخصصا بشكل عام على حساب الإنتاجية، مما يجعل الدراسات المظهري ديناميكية أكثر صعوبة. الأهم من ذلك أن الاحتياجات من حيث التكلفة والبنية التحتية لهذه المنصات الراقية جعلها في معظمها غير مجدية لتنفيذها في مختبرات أصغر.
كما وضعت منصات التي تستخدم أكثر القياسية التقاط الصور التكنولوجيا ومناسبة تماما لقياس الاستجابات الحيوية مثل استجابة الجذر إلى التحفيز الجاذبية. على سبيل المثال، استخدمت الكاميرات CCD لالتقاط ردود الشتلات الفردية للضوء والجاذبية في ارتفاعالمكانية والزمانية القرار 1،8،12. وقد تم تطوير أنظمة أخرى تسمح بقياس التوجه طرف الجذرية للجذور متعددة من صورة واحدة (على سبيل المثال RootTipMulti من قبل iPlant التعاونية) 17،24. في الحالة الأولى، ومنخفضة نسبيا نظرا الإنتاجية التي الشتلات واحد فقط هو تصويرها من قبل كل كاميرا في وقت واحد، في حين أنه في الحالة الأخيرة إنتاجية أعلى، ولكن عموما على حساب القرار.
الإجراء المذكورة في هذه الورقة يقدم منبرا لالتقاط صور عالية الدقة في إنتاجية عالية مع المعدات والبرمجيات التي تتوافر بسهولة وبأسعار معقولة نسبيا. باستخدام هذا الإعداد، 1،080 الاستجابات الفردية الجذرية يمكن جمع كل أسبوع في مختبر واحد مجهزة البنك من ستة الماسحات الضوئية. في 15 شهرا من جمع ما معدله 864 الاستجابات الفردية في الأسبوع، تم مسحها ما مجموعه 41،625 شتلة لدراسة علم الجينوم. حوالي 15٪ من المجموعات الفردية فشلت بسبب خطأ في الإعداد، الشبكاتفشل كايزرسلوترن أو عطب في المعدات. فشل 22٪ استجابات أخرى بسبب نقص إنبات أو نمو الجذور غير كافية لاستثارة رد فعل النمو. مجموعة البيانات النهائية يتكون من 27475 الردود الشتلات الفردية لحافز الجاذبية من 163 السلالات المؤتلف زائد 99 خطوط إسوي القريب. وقد تم جمع البيانات في مختبر واحد، مما يجعل هذا النهج جدا عالية الإنتاجية. حتى بالنظر إلى أن المعدات المستخدمة لاكتساب غير مكلفة نسبيا، وتعمل ذلك بشكل موثوق لأكثر من عامين حتى مع الاستخدام الكثيف.
بينما كان هذا البروتوكول مفيدة جدا للأهداف البحثية من هذه المجموعة، بعض القيود لا تزال موجودة. بسبب الإنتاجية من نحو 50 غيغابايت من البيانات غير المضغوطة صورة في اليوم الواحد، كان من الواضح أن هناك حاجة إلى كمية كبيرة من مساحة المنزل إلى صور ما لم يمكن وضع خطط ضغط فعالة. تم حل مشكلة التخزين مؤقتا من خلال شراء محركات الأقراص الصلبة الخارجية لكل كمبيوتر. بالإضافة إلى ذلك، اثنين من 1تم شراء أجهزة التخزين المرتبطة الشبكة 0 السل. في وقت لاحق، تم تطوير خوارزميات الضغط، كما هو موضح أعلاه، والتي يمكن أن تساعد في تقليل حجم البيانات بنسبة تصل إلى 60٪ (الشكل 8). من المهم أن نلاحظ أن السرعة التي يمكن حفظ البيانات إلى الشبكة المرتبطة جهاز تخزين يعتمد على سرعة الاتصال بالشبكة. كما تم تقييد أنظمة الضغط بسبب الرغبة في منع فقدان بيانات الصورة.
ويجري أيضا تعتبر قيود أخرى محددة لنظام التصوير القائم على الماسح الضوئي. على سبيل المثال، معرضون في النهج القائم على الماسح الضوئي الشتلات إلى ارتفاع شدة الضوء في نطاقات الأشعة تحت الحمراء البيضاء ويحتمل أن تكون خلال كل فحص. هذا من المرجح يؤثر على نمو البادرات، على الرغم من الشتلات لا يزال من الممكن للخضوع لاحظ استجابات قوية لحافز الجاذبية (الشكل 7). تحسن في المستقبل قد تشمل البرمجة الماسحات الضوئية بحيث المصابيح الحمراء فقط هي النشطة. منطقة نشطة في التنر هو خلق خوارزميات التحليل مطابقة تماما لهذا القرار ومرت من هذه البيانات الصورة. وكانت مجموعة كبيرة من البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا الأسلوب القائم على الماسح الضوئي مثالية لتطوير أدوات قوية لعالية الإنتاجية phenotyping من الصور الشتلات. خوارزمية ضغط يعملون على هذه الصور هو مبين في الشكل 7 يدعم الادعاء بأنهم قابلة للتطبيقات تحليل الصور. علاوة على ذلك، الصور الناتجة يمكن تحليلها بواسطة خوارزمية المنشورة سابقا، RootTrace 17،24، إن جمعت في دقة أقل (أقل من 1،200 نقطة في البوصة)، وتتم تجزئة الشتلات الفردية من الصورة باستخدام خوارزمية ضغط المذكورة أعلاه قبل التحليل. ويمكن استخراج البيانات نمو الجذور من الصور خفضت إلى 1،200 نقطة في البوصة في حين يمكن استخراج البيانات زاوية غيض من الصور خفضت إلى 900 نقطة في البوصة (المراقبة غير منشورة).
الإجراء المذكورة في هذه الورقة يلائم مكانته الخاصة في عالم رور التصوير في أنه من إنتاجية عالية ودقة عالية في حين لا تزال معقولة نسبيا. فائدة إضافية لهذا النهج هو أنه يمكن بسهولة أن تكون مخصصة لتلبية احتياجات التصوير من مجموعة أبحاث خاصة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية (الجائزة عدد IOS-1031416) وأجريت بالتعاون مع ناثان ميلر، لوغان جونسون وإدغار سبالدينج من جامعة ويسكونسن وبريان Bockelman، كارل Lundstedt وديفيد سوانسون من مركز جامعة نبراسكا في هولندا الحاسبات.
Materials
| Epson Perfection V700 Photo Scanners | Epson | B11B178011 | – |
| Plexiglas Scanner Template | – | – | Custom made. See Figure 2. |
| Smart Strap Bungee Cords | SmartStraps | Wal-Mart 1079478 | |
| Brinks Digital Outdoor Timers | Brinks | Wal-Mart 42-1014-2 | |
| VueScan Software | Hamrick Software | http://www.hamrick.com | |
| Segmentation Software | Chris Wentworth, Doane College | https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation | |
| 3M Micropore Tape | Fisher Scientific | 19-061-655 | – |
| Holding racks | – | – | Custom made by gluing two cookie racks together. |
References
- Miller, N. D., Brooks, T. L. D., Assadi, A. H., Spalding, E. P. Detection of a gravitropism phenotype in glutamate receptor-like 3.3 mutants of Arabidopsis thaliana using machine vision and computation. 유전학. 186, 585-593 (2010).
- Clack, N. G. Automated Tracking of Whiskers in Videos of Head Fixed Rodents. PLoS Comp. Biol. 8, (2012).
- Lussier, Y. A., Liu, Y. Computational approaches to phenotyping: high-throughput phenomics. Proc. Am. Thoracic Soc. 4, 18-25 (2007).
- Houle, D. Colloquium Paper: Numbering the hairs on our heads: The shared challenge and promise of phenomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1793-1799 (2009).
- Elwell, A. L., Gronwall, D. S., Miller, N. D., Spalding, E. P., L, T. D. B. Separating parental environment from seed size effects on next generation growth and development in Arabidopsis. Plant Cell Env. 34, 291-301 (2011).
- Silk, W. K. Quantitative Descriptions of Development. Ann. Rev. Plant Physiol. 35, 479-518 (1984).
- Cronin, C. J., Feng, Z., Schafer, W. R. Automated imaging of C. elegans behavior. Methods Mol. Biol. 351, 241-251 (2006).
- Miller, N. D., Parks, B. M., Spalding, E. P. Computer-vision analysis of seedling responses to light and gravity. Plant J. 52, 374-381 (2007).
- Iyer-Pascuzzi, A. S. Imaging and Analysis Platform for Automatic Phenotyping and Trait Ranking of Plant Root Systems. Plant Physiol. 152, 1148-1157 (2010).
- Houle, D., Mezey, J., Galpern, P., Carter, A. Automated measurement of Drosophila wings. BMC Evol. Biol. 3, 25 (2003).
- Jahnke, S. Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions. Plant J. 59, 634-644 (2009).
- Durham Brooks, T. L., Miller, N. D., Spalding, E. P. Plasticity of Arabidopsis Root Gravitropism throughout a Multidimensional Condition Space Quantified by Automated Image Analysis. Plant Physiol. 152, 206-216 (2010).
- Perrin, R. M. Gravity signal transduction in primary roots. Ann. Botany. 96, 737-743 (2005).
- Strohm, A. K., Baldwin, K. L., Masson, P. H. Molecular mechanisms of root gravity sensing and signal transduction. Dev. Biol. 1, 276-285 (2012).
- Harrison, B. R., Masson, P. H. ARL2, ARG1 and PIN3 define a gravity signal transduction pathway in root statocytes. Plant J. 53, 380-392 (2007).
- Swarup, R., Bennett, M. J., Beeckman, T. . Root Development. , 157-174 .
- French, A., Ubeda-Tomás, S., Holman, T. J., Bennett, M. J., Pridmore, T. High-throughput quantification of root growth using a novel image-analysis tool. Plant Physiol. 150, 1784-1795 (2009).
- Granier, C. PHENOPSIS, an automated platform for reproducible phenotyping of plant responses to soil water deficit in Arabidopsis thaliana permitted the identification of an accession with low sensitivity to soil water deficit. New Phytol. , 169-623 (2006).
- Walter, A. Dynamics of seedling growth acclimation towards altered light conditions can be quantified via GROWSCREEN: a setup and procedure designed for rapid optical phenotyping of different plant species. New Phytol. 174, 447-455 (2007).
- Gregory, P. J. Non-invasive imaging of roots with high resolution X-ray micro-tomography. Plant Soil. , 255-351 (2003).
- Pierret, A., Kirby, M., Moran, C. Simultaneous X-ray imaging of plant root growth and water uptake in thin-slab systems. Plant Soil. 255, 361-373 (2003).
- Naeem, A., French, A. P., Wells, D. M., Pridmore, T. P. High-throughput feature counting and measurement of roots. Bioinformatics. 27, 1337-1338 (2011).
