자연의 전송에 결핵 말라리아 동시 감염을 연구하는 실험 모델 결핵균와 변형체 berghei</i

안전 대책 및 윤리 정책 제시된 연구는 여기에 인간의 병원체 Mtb의 및 설치류 말라리아 기생충 변형체 berghei (P. berghei)와 함께 작업을 포함한다. Mtb의 (변형 H37Rv)와 P. 실험 berghei 적절한 바이오 안전성 조건 하에서 수행되어야합니다. 바이오 안전성 레벨 (BSL) 2 실험실은 같은 피와 같은 설치류 말라리아 기생충에 필요한 따라서 berghei과 Mtb의를위한 BSL 3는 모든 동시 감염 연구를 위해 여기에 설명. 참고 : Mtb의에 감염된 쥐가 바로 인근에 다른 마우스에 (우리 자신의 관찰을) 감염이 확산되지 않습니다. 실험에 확산 때문에 제외 될 수 있지만 적절한 보호 복은 항상 BSL 3 실험실 안에 착용해야합니다. 우리의 규칙에 따르면, 실험자는 외부 하나가 언제에게 폐기가되는 외과 수술, 헤어 네트, 일회용 호흡기, 장갑 두 쌍을 착용RMS는 캐비닛에서 제외됩니다. 새로운 다시 장에 들어가기 전에 배치됩니다. 두 개의 컨테이너, 2 % Buraton 한 (주 : Mtb의 불 활성화가 승인 다른 소독제가 승인 된 농도로 사용할 수 있습니다) 액체 및 감염성 폐기물과 표면 오염 제거를위한 하나, 실험 전에 준비 캐비닛 내부에 배치됩니다. 또한, 비닐 봉투는 고체 감염성 폐기물에 사용됩니다. 독일어 규칙에 따르면, Mtb의에서 파생 된 MTB 자전거 문화 또는 조직의 취급 및 처리를 포함한 모든 작업은 마우스 BSL3 실험실 내에서 2 등급 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 감염. 마이코 박테리아를 처리하는 동안, 대책은 항상 에어로졸의 생성을 피하도록주의해야한다. 6~8주 세 사이의 여성 C57BL / 6 마​​우스 (찰스 리버는) 모든 동시 감염 실험에 사용 BSL의 특정 장벽 조건 3 시설에서 유지되었다. 동물 보호 및 실험은 PE했다농업, 환경, 슐레스비히 – 홀슈타인의 국가의 농촌 지역에 대한 정부의 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 rformed 말라리아 모기 단계를 얻기 위해, NMRI 생쥐는 찰스 리버 연구소, Sulzfeld, 독일에서 구입 한 및 대학 하이델베르크 동물 시설 (IBF) 내에서 무균 조건 하에서 유지. 모든 동물 실험은 유럽의 규정에 따라 수행 바덴 뷔 르템 베르크 주 (Regierungspräsidium 카를 스루에)의 상태 당국에 의해 승인되었습니다. 1. GLAS-골 에어로졸 챔버를 사용하여 Mtb의와 마우스의 에어로졸 감염 Mtb의와 실험 동물의 에어로졸 감염을 표준화하는 가장 좋은 방법은 알려진 CFU 역가와 냉동 주식에서 마이코 박테리아를 사용하는 것입니다. 주식의 문화를 준비하려면, 미들 7H9 국물 문화 Mtb의는 OADC (올레 보충산, 알부민, 덱 스트로스, 카탈라제) 농축 중형 및 0.05 % 트윈 80, 마이코 박테리아에 대한 탄소 공급원과 동시에 세균의 응집을 방지하기 위하여 측정한다. 문화는 수확시에 외경 ≤ 1이 있어야합니다. 높은 OD에서, 박테리아의 응집이 증가하고 생존 능력 감소. C. ° -80에서 보관 1 ㎖ 분량 씩 0.5 % 글리세롤, 1g / L 아스파라긴 보충 7H11 한천 접시에 세 가지 독립적 인 유리 병의 10 배 희석 시리즈를 도금하여 냉동 주식에 단위 (CFU)를 형성 가능한 식민지의 수, OADC을 결정하고 4 후 식민지를 열거 37 ° C에서 배양 주 아래에 설명 된대로 에어로졸 감염을 수행합니다. 신중하게 해동 MTB 자전거 알려진 CFU 역가의 주식과는 27 G 바늘 장착 된 1 ML의 주사기를 사용하여 세균 덩어리를 분산하기 위해 서스펜션 다섯 번 섞는다. 에어로졸의 생성을 피할 수 있습니다. 원하는 감염 량에 따라, 마이코 박테리아에 콘텐츠의 볼륨을 전송 필요멸균 PBS를 함유하는 50 ㎖ 튜브. 최종 부피는 10 ㎖의입니다. NOTE :이 현탁액에, 미생물의 수를 조절함으로써, 에어로졸 방울 베어링 박테리아의 비율이 변화된다. 우리는 일반적으로 폐 (저용량 감염) 당 100 가능한 균의 이해를 목표로하고 있습니다. 우리의 경험이 5.5 ㎖를 분무하는 6 ML의 총 부피의 1 ~ 2 × 10 6 Mtb의 / ㎖ (아래 참조)이 필요합니다. 그것은 당신의 감염에 대한 최적의 조건을 찾기 위해 박테리아의 다른 농도로 실험 에어로졸 도전하는 일련의 작업을 수행하는 것이 좋습니다. 최대 5000 미코 박테리아와 고용량 감염 5 박테리아 적게 성공적 에어로졸로 생쥐에 감염하는 데 사용될 수있는 한, 감염성 과정을 가속화하기 위해 수행 될 수있는 반면. 감염 속도는 일반적으로 100 %입니다. 접종 역가를 결정하는 도금을 위해 (필요한 최종 부피를 초과 준비) 충분한 볼륨을 제거, 우리가 일반적으로 기술 삼중를 플레이트에 500 μl를 제거합니다. 에 동물을 배치복실 메쉬 원형 에어로졸 챔버 내의 바스켓 (바구니 당 하나의 마우스) 및 에어로졸 챔버의 뚜껑을 닫습니다. 주 : 다른 모델이 20 쥐를 수용 할 수있는 각각의 다섯 각각의 구획으로 구성 원형 모양의 바구니를 갖추고 있습니다. 세 스테인리스 소켓 조인트 벤 투리 – 분무기 장치를 연결합니다. 18 G 무딘 바늘로 장착 된 10 ㎖ 주사기로 50 ML 튜브에서 마이코 박테리아 현탁액을 제거하고 밀폐 된 운송 상자에 에어로졸 챔버에 주사기를 수행한다. 분무기 장치의 나사 캡을 제거하고 조심스럽게 분무기로 마이코 박테리아 현탁액을 주사. 에어로졸의 생성을 피하십시오. 2 %를 함유 Buraton 미강 용기에 주사기를 버린다. 스크류 캡으로 분무기를 밀봉. 주 전원 스위치와 UV 램프를 전환합니다. 제어 키패드 디스플레이는 "GLAS-콜기구 협력"을 보여줍니다. 프로그램의 스위치를 켭니다. 디스플레이 의지보여 "분무기가 준비 됐나요?" "바구니가 장착되어 있습니까?"준비가되면 Enter 키를 누르십시오. " Enter 키를 누르십시오. 디스플레이는 "예열 시간 900 입력"을 보여준다이 900 초입니다 (배출 공기를 decontaminates) 소각로의 예열 시간을 의미한다. Enter 키를 누르십시오. 디스플레이는 표시 "Nebulizing 시간 1,800 입력"을 것이다이 nebulizing 시간은 기본적으로 1800 초 설정을 의미합니다. nebulizing 시간을 연장하기 위해, "2400"을 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 참고 : nebulizing 사이클 동안, 압력 공기가되어 결핵균을 포함하는 작은 에어로졸 방울을 생성, 현탁액을 분무. 주 공기 흐름,이 액적 (크기는 약 2-5 μM)는 에어로졸 챔버로 운반된다. 디스플레이는 표시 "CD 시간 1,800 입력"을 것이다이 붕괴 사이클이 1,800 초 소요 것을 의미한다. "2400"를 입력하고 Enter를 누르십시오로 설정합니다. 참고 :이주기 동안, 클라우드하는 u에게 내장 된nebulizing주기 동안 에어로졸 챔버 p는 부패 할 수 있습니다. 작은 물방울은 실험 동물에 흡입된다. 디스플레이는 "12 월 시간 (900)를 입력합니다"가 표시됩니다, 이것은 자외선 살균주기가 900 초를 취할 것을 의미합니다. Enter 키를 누르십시오. 기계는 예열, nebulizing, 클라우드 부패와 UV 살균을 통해 순환하기 시작합니다. 주의 :; 및 사이클 시작 nebulizing 때 압축 공기 유량계 10입방피트 / 시간이 (점검, 따라서 공기 제어 밸브를 조정 진공 유량계 (필요한 경우 진공 조절 밸브를 조절 예열 사이클이 시작될 때 선택) 60입방피트 / 시간을 표시해야 ). 사이클이 완료되면 키패드는 "프로세스 완료 – 표본을 제거"보여줄 것이다. 프로그램, UV 및 주 전원 스위치를 끄십시오. 미코 박테리아 현탁액을 분무하고 완전하지 않을 경우, 정중 장착 적절한 주사기와 서스펜션을 제거하여 남은 볼륨을 기록 하였는지 확인18 G 무딘 바늘. 나머지 볼륨 이상 1 ㎖이어야한다. 관절에서 분무기를 제거하고 2 시간의 최소 2 % Buraton가 들어있는 냄비에 배치, 보통 소독은 O / N.에게 수행 그 후, 새로운 팬에 분무기를 전송하고 물로 깨끗이 헹군다. 공기 건조에 분무기를 남겨주세요. 에어로졸 챔버를 열고 자신의 새장에 동물을 반환합니다. 오토 클레이브 가방과 오토 클레이브 가방 바구니. . 안전을 위해 전원이 공급되는 공기 정화 호흡기가이 절차를 수행하는 동안 착용해야합니다 : 2 % Buraton 주와 에어로졸 챔버의 내부 표면을 닦아냅니다. 7H11 한천 플레이트에 기술 세중 (3 × 100 μL)의 접시 10 배 희석 (단계 1.3 참조) 마이코 박테리아 현탁액의 나머지 500 μl를 사용. 2. 폐에 원하는 CFU의 이해를 확인 실험 동물의 에어로졸 감염 후 어느 날 세균 LO를 결정원하는 CFU의 이해를 확인하기 위해 지정된 제어 동물의 폐에있는 광고. 참고 : 우리는 보통 하루에 1 CFU 결정을위한 3-5 마우스의 별도의 그룹을 지정합니다. 시간 경과의 mtb 감염 과정을 모니터링하기 위해, 마이코 박테리아 티슈 부담 CFU 검지 전체 장기 균질의 일련의 희석액을 도금에 의해 검사 될 수있다. 폐 결핵의 질병 증상에 대한 기본 사이트 그러나 비장, 간, 림프절은 보통 따라 분석이다. 도금 될 희석 조직뿐만 아니라 행 기관 및 시점에 다른 세균 부하를 일으킨다 초기 접종 (고용량 대 저용량)에 따라 기관의 예상 미코 박테리아 하중에 의존 분석. 저용량 감염되면, 폐 Mtb의 H37Rv의 세균 부하는 일반적으로 하루에 25 ~ 30 사이의 고원에 도달한다. CO 2 질식 또는 : 안락사 동물 (안락사를 배치터미널 클래스 II 생물 안전 캐비닛의 해부 보드에 흡수 종이에 마취), 70 % 에탄올로 마우스를 소독. 참고 : 70 % 알코올은 표면의 오염 제거 용으로 Mtb의를 죽일 수 없습니다. 복부의 중간에 작은 절개를하고 머리 위에 마우스 피부를 후퇴. 수술 가위로 복부와 흉부 케이지를 열고 폐 액세스 할 수 있도록 흉부 벽을 제거합니다. 폐를 제거하고 균질화 버퍼 (멸균 / 1 %의 v / V 트윈 1분의 80 중량 % / V 알부민)과 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 작은 배양 접시에 100 ㎛의 체를 통해 5 ML의 주사기 변형 폐의 플런저를 사용. 세척 체를 여러 번 장벽 팁을 탑재 한 1 ㎖ 피펫을 사용하여 8 한천 플레이트 사이에 폐 균질 배포 (CA 250 μL / 판;. 있는지 그들은 잘 건조 된 표면을 가지고 있는지 확인). 조심스럽게 2 %에 버려진 일회용 살포기를 사용하여 샘​​플을 접시Buraton. 캐비닛 내부 건조 한천 플레이트를 남겨주세요. , 파라 필름으로 모든 단일 플레이트를 밀봉 알루미늄 호일에 싸서 적어도 4 주 동안 37 ° C에서 똑바로 품어. 3. 탈출 방지 모기 케이지 건설 설치류 변형체 균주는 인체에 유해하지 않습니다. 그러나, Mtb의 감염된 생쥐는 기생충과 작업받는 사람이기 때문에이 BSL 3 조건에서 이루어집니다,주의 사항은 자신의 새장을 탈출하는 모기를 방지하기 위해 필요합니다. 계획 감염의 처방에 따라, 고압 멸균 및 금속 프레임 케이지 또는 직접 만든 일회용 케이지 재사용을 사용할 수 있습니다. 실험 동물의 물린 감염에 의해 마우스 당 모기의 정의 수에 의해 수행 될 것을 요구되는 경우에 후자의 사람을 권장합니다. 자체 제작 케이지가 필요한 경우, 모기와 실험실의 안전 보건 등의 정확한 사양에 새장을 준비는 게 아무것도에 따라 달라집니다차 구조 (그림 2). 같은 반 파인트 아이스크림 상자 또는 종이 커피 컵 (그림 2)와 같은 상자를 가져 가라. 상자의 측면에 작은 구멍을 잘라 모기에 대한 보안 입구를 만들 수있는 각 조각으로 잘라 슬릿 라텍스의 두 층으로 커버. 참고 : 개방 2cm × 2 cm의 전체 크기를 가지고, 우리가 가지고 및 / 또는 테이크 아웃 모기를 위해 사용하는 튜브 (흡인기 장치)는 진공 펌프에 부착 된 수정 15 ML 팔콘 튜브이며, 따라서 역할 1.5 cm의 직경을 갖는 흡입기. 물감을 흡수하기 위해 상자의 안쪽 하단에 필터 종이를 테이프. 그물 (나일론 메쉬의 더블 레이어, 크기 1mm x 1 ㎜)과 아이스크림 컵을 닫고 테이프와 고무 밴드로 상자에 고정. 마우스 당 모기의 정의 번호가 필요 감염 실험을 위해, 15 감염된 모기에 새장을 준비하는 각 이상적으로 AV를 포함10,000 야생형 침샘 P.의 erage berghei의 포자 소체. 이상적으로, 이전에 혈액 식사를 수행하는 24 시간 동안 모기를 굶어. 4. 모기에 물린 상처에 의해 쥐의 말라리아 감염 여기에 사용되는 설치류 말라리아 기생충은 P.입니다 berghei 그러나 또한 다른 설치류 변형체 균주가 사용될 수있다. 감염 모기를 얻으려면 포자 소체 전송을 위해 기생충의 전체 수명주기는 척추 호스트 (마우스)와 모기 벡터에서 모두 유지됩니다. 기생충의 유지 보수 insectary에서 수행된다. 자연의 전송 실험을 위해, 침샘 당 포자 소체의 최소 수는 더 적은 10,000 이상이어야한다. 자세한 프로토콜의 기생충 관리에 우리는 여자 이름 등으로 말라리아 연구 방법을 참조하십시오., 2013. 순진 마우스 또는 케타민과 Mtb의와 40 일 동안 preinfected 동물을 마취시키다 (100 ㎎ / ㎏)복강 내 주사 (200 μL / 마우스)에 의해 자일 라진 (7 ㎎ / ㎏) 솔루션입니다. 참고 : Mtb의 변형체와 감염 사이의 시간은 기본 연구 문제에 따라 조정할 수 있습니다. 마찬가지로, 병원체 도전 순서가 역전 될 수있다, 즉 마우스는 종래의 mtb 감염으로 감염성 모기에 물린에 노출 될 수있다. 모기 케이지 (마우스 비율 정의 모기 모기 케이지 당 하나의 마우스)의 그물에 마취 마우스를 놓고 모기가 10 ~ 15 분 동안 멤브레인을 공급 할 수 있습니다. 참고 : 모기 용기에있는 혈액의 존재는 먹이 때문에, 포자 소체 전송을 의미한다. 다시 자신의 새장에 마우스를 이동하고 마취에서 깨어 때까지 지속적으로 감독. 종이 수건이 아니라 침구 (질식의 위험)에 장소 마우스 및 (긴밀히 장소와 종이 타월로 몸을 커버)을 따뜻하게 유지 : 주. 순중량을 70 % 에탄올이나 다른 소독제로 살포하여 모기를 죽이케이지의 주입. 처분 할 수있는 사람이 사용 된 경우 오토 클레이브 케이지 및 폐기. 5. 모니터링 기생충 빵꾸 꼬리는 매우 바늘로 종료하고 슬라이드의 각 끝 부분에 혈액 한 방울을 수집에서 정맥. 슬라이드의 길이의 절반 이상이 혈액 한 방울을 끌어 다른 슬라이드를 사용합니다. 제 스미어위한 다른 에지를 사용하는 확산기 위에 플립. 건조한 공기에 슬라이드를 둡니다. 지엠 사 (Giemsa) 염색 슬라이드 홀더에 슬라이드를 삽입하고 절대 메탄올 간단한 침수에 의해 혈액 얼룩을 고정합니다. 참고 : 유리 도자기의 사용은 우리가 모든 솔루션을 폴리 프로필렌 큐벳을 사용하는 BSL 3 최소한으로 유지해야하기 때문에. 지엠 사 (Giemsa)의 번지 (탈 이온수 1:10)을 담가. 10 분 후, 여분의 얼룩을 멀리 씻어 탈 이온수로 몇 번 못 염색 큐벳에서 밖으로 슬라이드를 찍어. 마지막으로, 수직 위치에서 공기 건조 슬라이드. 대안 얼룩 : 라이트 & #180;의 얼룩 메탄올 1 ㎎ / ㎖의 농도에서 라이트의 얼룩을 녹입니다. 사용하기 전에 접은 필터를 통해 필터링합니다. 염색 용액에 혈액 얼룩을 담그고 4 분 동안 배양한다 (참고 : 염색 액을 기준으로 메탄올 같이 얼룩의 메탄올 고정이 필요하지 않습니다). 상술 한 바와 같이 탈 이온수 세척 슬라이드로 세척하고 건조한 공기에 슬라이드를 둡니다. 지엠 사 (Giemsa) / 라이트의 기미가 완료되면, 부드럽게 Buraton 함유 폐기 냄비에 사용 된 모든 시약을 전송합니다. 혈액 얼룩 분석 기름 침수와 100 배의 배율로 광학 현미경에 의해 스테인드 혈액 얼룩을 분석합니다. 적혈구가 단층 배열되어 혈액 도말 표본의 영역에 감염되지 않은 감염된 적혈구 횟수. 잘 정의 기생충을 달성하기 위해서, 적혈구 단층 표시 뷰의 적어도 10 개의 다른 필드를 센다. calcul을적혈구의 수에 의해 기생 적혈구 수를 나누고 100을 곱하여 (% 단위)의 상대 기생충 먹었다.