JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

Изоляция, культура и Визуализация человека плода поджелудочной кластеров клеток

Published: May 18, 2014
doi:
10.3791/50796
, , ,
1Pediatric Diabetes Research Center, Department of Pediatrics,University of California, San Diego

Summary

Протокол изолировать, культура, и образ островковых клеток кластеры (МКК), полученные из эмбриональных клеток поджелудочной железы человека описывается. Метод подробно описаны шаги, необходимые для создания МКК из ткани, культуры как монослоев или в суспензии, как агрегатов и изображения для маркеров пролиферации и поджелудочной клеточных судеб.

Abstract

В течение почти 30 лет, ученые показали, что фетальные МКК человека пересаженные под почечную капсулу голых мышей превратился функционирует эндокринных клеток, о чем свидетельствует значительное увеличение циркулирующих человека С-пептида следующие раздражения глюкозой 1-9. Однако в пробирке, генезис, продуцирующих инсулин клеток из ИКЦ плода человека низка 10; Результаты напоминают последние экспериментов, выполненных с человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК), возобновляемым источником клеток, которые держат большие перспективы в качестве потенциального терапевтического лечения для диабета 1 типа. Как ККО, трансплантация частично дифференцированного чЭСК генерировать глюкозы реагировать, продуцирующих инсулин клетки, но в пробирке генезиса, продуцирующих инсулин клеток из чЭСК гораздо менее надежными 11-17. Полное понимание факторов, влияющих на рост и дифференцировку эндокринных клеток-предшественников, вероятно, потребует данных, полученных от обоих ККО и онШкала Хотя ряд протоколов существуют для создания инсулина продуцирующие клетки из чЭСК в пробирке 11-22, гораздо меньше существовать ICCS 10,23,24. Часть этого несоответствия вероятно происходит от сложности работы с поджелудочной железы плода человека. С этой целью мы продолжаем опираться на существующие методы, чтобы изолировать плода островки из человеческих поджелудочной железы с сроках беременности, начиная от 12 до 23 недель, растут клетки как монослоя или в суспензии, и изображение для пролиферации клеток, поджелудочной маркеров и человеческих гормонов в том числе глюкагона и С-пептида. МКК генерируется в соответствии с протоколом, описанным ниже в результате С-пептида выпуска после трансплантации под почечную капсулу голых мышей, подобных С-пептида уровней, полученных путем трансплантации свежей ткани 6. Хотя примеры, представленные здесь, сосредоточиться на поджелудочной распространения энтодермы и β клеток генеза, протокол может быть использован для изучения других аспектов развития поджелудочной железы, В том числе экзокринной, протоков и других гормонов продуцирующих клеток.

Introduction

Основным ограничением на основе клеток инсулина терапии замены при сахарном диабете 1 типа является нехватка человеческих островков, доступных для трансплантации. Возможность регулировать пролиферацию и дифференцировку клеток поджелудочной железы прекурсоров человека в инсулин-продуцирующие клетки, которые отвечают метаболические потребности в состоянии инсулина с дефицитом остается критической строительный блок для клеточной терапии для лечения диабета типа 1.

До появления чЭСК полученных инсулин-продуцирующие клетки, человека плода поджелудочной эндокринных клеток или их предшественников не рассматривались в качестве потенциальных источников клеток для клинического трансплантации. Хотя научная и нормативно-ландшафт изменился за последние несколько лет, остается насущная необходимость понять, как развивается поджелудочная железа плода человеком. Многие сейчас посмотреть терапевтическое использование эмбриональных клеток человека, вряд ли, однако, если были установлены эффективные и безопасные методы по расширению клетки, терапевтическое использование этих клеток может AGАйн быть изучены. Главным препятствием, что остается в том, что в пробирке трансформации эмбриональных клеток поджелудочной железы агрегатов человека (МКК) в глюкозу реагировать, секретирующие инсулин эндокринных клеток в настоящее время неэффективный процесс. Хотя много работы на протяжении почти 30 лет выяснены, и определили профиль экспрессии транскрипционных факторов, необходимых для развития поджелудочной железы, эндокринной, остаются пробелы в наших знаниях о том, как временная экспрессия транскрипционных факторов регулируется и связан с клеточной функции.

До появления чЭСК полученных инсулин-продуцирующие клетки, человека плода поджелудочной эндокринных клеток или их предшественников не рассматривались в качестве потенциальных источников клеток для клинического трансплантации. Хотя научная и нормативно-ландшафт изменился за последние несколько лет, остается насущная необходимость понять, как развивается поджелудочная железа плода человеком. Многие сейчас посмотреть терапевтическое использование эмбриональных клеток человека в качестве Вряд ли, однако, если эффективными безопасные методы для расширения были установлены клетки, терапевтическое использование этих клеток может снова быть изучены. Главным препятствием, что остается в том, что в пробирке трансформации эмбриональных клеток поджелудочной железы агрегатов человека (МКК) в глюкозу реагировать, секретирующие инсулин эндокринных клеток в настоящее время неэффективный процесс. Хотя много работы на протяжении почти 30 лет выяснены, и определили профиль экспрессии транскрипционных факторов, необходимых для развития поджелудочной железы, эндокринной, остаются пробелы в наших знаниях о том, как временная экспрессия транскрипционных факторов регулируется и связан с клеточной функции.

В последнее поле стволовых клеток использовала накопленных знаний о временной экспрессии фактора транскрипции во время развития островков вести производство клеток, которые экспрессируют маркеры зрелых эндокринных клеток. Хотя генезис, продуцирующих инсулин клеток из чЭСК и индуцированных плюрипотентных клеток (IPSC) позволил добиться существенного изначительные успехи в последние несколько лет, наиболее эффективные протоколы требуют два отдельных этапа дифференцировки: 1) ранней дифференциации в пробирке для генерации клеток, экспрессирующих поджелудочной транскрипционные факторы предшественника, после чего 2) созревания в естественных условиях после пересадки – так называемый "черный ящик "период. Чтобы двигаться вперед, прогресс в понимании биологии основной островок созревание в естественных условиях, вне зависимости от источника клеток, следует понимать на биохимическом уровне. Сходство между результатами, полученными с МКК и чЭСК предполагает, что ряд критических биохимических процессов, которые регулируют переход клеток поджелудочной железы прекурсоров человека в зрелые, глюкозы отзывчивых, инсулина секреции клеток в пробирке остается неизвестным. Центральная часть этого понимания будет заключаться в разработке новых методик для получения популяции функциональные эндокринные клетки поджелудочной железы клеток-предшественников и чЭСК потребует не только биохимическую проверoaches, что выяснить созревания события, но методы анализа изменения.

Почему мы считаем, что визуализации плода клетки поджелудочной железы человека является одним из важнейших аспектов выявление изменений в островковых созревания? Ответ лежит частично в историческом стремлении генерировать инсулина продуцирующие клетки. Оба модели и системы ткани культуры для поджелудочной прекурсоров и островков позволили исследователям изучить существенные различия, которые существуют между созревания островков животных и человека островков в пробирке. Ограничение к исследованию человеческого развития плода поджелудочной железы является то, что гестационный возраст, которые можно использовать на законных основаниях только порождают гетерогенных клеточных агрегатов. Хотя изолированные плода человека клетки напоминают островки, окрашивание после культивирования в пробирке с гестационном возрасте 9-23 недель показывает менее 15% содержат маркеры для эндокринных клеток, при этом большинство клеток не окрашивания для островковых гормонов. Однако после трансплантации и вVivo созревание, подавляющее большинство клеток выразить эндокринных маркеров 6,25. Результаты этих исследований в настоящее время повторил сегодня с чЭСК дифференциации протоколов, которые только способны генерировать скромные популяции одного гормона положительных эндокринных клеток после экстракорпорального дифференциации в методы. В пробирке для повышения популяции гормонов позитивных клеток, вероятно, обеспечить понимание островок в естественных условиях созревания. Кроме того, понимание молекулярных событий, которые ведут плода поджелудочной человеческого развития, скорее всего, улучшить усилия по извлечению инсулина продуцирующие клетки из чЭСК и дополнительное уточнение границ механизмы, которые регулируют β регенерацию клеток и поджелудочной трансдифференцировку клеток.

Сходство между человеческой эмбриональной поджелудочной клетки и чЭСК созревания может быть продлен до функции клеток. Как мышиных клетках, как человеческие эмбриональные клетки и дифференцированные чЭСК не могут вырабатывать инсулин в ответ на глюкозупосле островков новообразования в пробирке 26,27. Однако, после трансплантации в голых мышей и созревания, как людских, так островковых клеток, как кластеров и продуцирующих инсулин клеток, полученных из чЭСК выставке эндокринной фенотипа. Через три месяца после прививки, почти 90% трансплантированных клеток из любой населения инсулина положительные, так и нормально функционировать, как определяется выпуском С-пептида 17,26. Эти результаты показывают, что трансплантация предоставляет контекстно и неопознанных сигналы, которые способствуют островок созревание. Оптимизированные протоколы визуализации, такие как описанный здесь, для плода клетки поджелудочной железы человека поможет в поисках выявления факторов, которые модулируют и ускорения созревания. Фундаментальный биохимический исследование человека плода клеток поджелудочной железы и чЭСК дифференцированных к эндокринной линии на данном этапе развития имеет важное значение для измерения эффективности созревания.

Следующий протокол, говорится в Figurе 1, обеспечивает наш текущий способ выделения эмбриональных клеток поджелудочной железы человека, называемого МКК от всей плода поджелудочной железы человека и визуализации этих клеток. Этот протокол требует первоначального подготовку клеток из ткани, которую можно затем выращивали в виде монослоя или в суспензии. Подготовка клеток для визуализации часто используемых маркеров пролиферации клеток эндокринной и созревания описывается.

Генерация и визуализации ККО в отсутствие или в присутствии различных химических агентов, модифицирующих обеспечивает быстрый метод, по сравнению с моделями трансплантации, чтобы помочь определить условия культивирования и соединения, которые ускоряют созревание плода клеток поджелудочной железы человека в полностью функциональный экзокринной, протоков, или гормон панкреатических клеток.

Protocol

Примечания перед началом работы: Человека поджелудочных желез плода были получены из врожденных дефектов исследовательской лаборатории, Университета штата Вашингтон (Сиэтл, штат Вашингтон, США), которые собирают ткань. Информированное согласие на донорства тканей, хранения и использования образцов была получена от доноров по центру. В заявлении согласие протокол был предоставлен в письменной форме и Университет Калифорнии, Сан-Диего человека Исследовательские Ограждения программа была утверждена целое исследование (Протокол № 081237XT). Очень важно сохранить как плода поджелудочной железы человека и контейнер, содержащий поджелудочную железу на льду в течение всей процедуры. Диссоциации и пищеварение должна быть выполнена как можно быстрее. Отправить в клинику, где поджелудочная железа плода человеком, получена из буфера для хранения и транспортировки поджелудочной железы. (RPMI-1640 + 10% нормальной человеческой сыворотки (NHS), 300 мМ трегалозы SG, пенициллин / стрептомицин, и фунгизон). 1. Препарирование плодов человека поджелудочной железы Растворите 5 мг коллагеназы RT XI в HBSS с получением конечной концентрации 2,5 мг / мл. Фильтр стерилизовать решение с шприцевой фильтр 0,22 мкм в стерильный (автоклавного) сцинтилляционный флакон и хранить при температуре 4 ° С. В капот культуры ткани, изложенные 2 стерильные чашки Петри, стерильные небольшой тигель (если тигель недоступен, небольшой стакан может быть замещена), стерилизованные ножницы и пинцет. Добавить 2 мл HBSS в одном блюде Петри мыть поджелудочную железу. Аспирируйте жидкость из трубки, содержащей фетальные поджелудочную железу, оставляя примерно 1 мл. Удалить поджелудочную железу с пинцетом в 60 мм чашки Петри без HBSS. Для этих экспериментов, фетальные МКК создаются из свежих поджелудочных желез с сроках беременности, начиная с 9 до 23 недель. Изоляция от поджелудочных желез на ранних gestionational возрастов трудно из-за размера поджелудочной железы. Протокол, вероятно применимы к гестационного возраста за 23 недель, однако приобретение рancreata после этого времени затруднено из-за федеральных (США) ограничений. Иногда фетальной поджелудочной железы поступает с селезенки, жира или соединительной ткани прикрепленной от первоначального вскрытия. Дополнительный ткань легко видны невооруженным глазом и должны быть удалены из поджелудочной железы перед началом протокола. Промыть поджелудочной железы в минимальном объеме холодной HBSS (~ 0,5 мл) в чашке Петри. Перемещение очищенные поджелудочной железы в небольшой стерильный тигле с помощью стерильного пинцета и место в ведерке со льдом. Поместите тигель в держателе для 50 мл трубки центрифуги и, используя 2 пары ножниц, энергично нарезать поджелудочной железы в течение нескольких минут. (Обычно 2-5 мин, но время зависит от размера и твердости ткани). Резка технику важно. Удерживая одну сторону ножниц в фиксированном положении движущегося только противоположные ручки. Кончики ножниц должна лежать на дне тигля. Продолжить с быстрым движением ножниц сломать поджелудочную железу в небольшойштук. Чем меньше кусочки ткани, тем лучше коллагеназы будет работать. Добавить 1,5 мл HBSS + рубленых до поджелудочной железы во флакон, содержащий коллагеназы и место в водяной бане шейкере до 37 ° С при 200 оборотах в минуту в течение 10 мин. Не проверять чаще, чем один раз в течение первых 5 минут. Переваривание время зависит от качества ткани, так мало, как 6 мин может быть достаточным. Конечная точка, когда частицы малы и равномерным. Заполните флакон (10-15 мл) с холодной HBSS, чтобы остановить активность коллагеназы. Поместите на льду и позволяют сгустки урегулировать в течение 10 мин. Часто в этой точке, некоторые гибель клеток произошло, и ДНК высвобождается в средствах массовой информации. Это может сделать средств информации "тягучий"; в этом случае, добавьте 100 мкл ДНКазы (10 мг / мл фондовый) к решению. После того, как ткань в сцинтилляционный флакон осела в течение 10 мин, аспирации от верхнего слоя, оставляя его немного меньше, чем наполовину (7-8 мл). Передача клеток в 15 мл коническую трубку, Добавить 5 мл HBSS. Центрифуга в течение 5 мин при 300 х г. Аспирируйте HBSS и ресуспендирования клеток в 5 мл среды, содержащей RPMI-1640, глютамаксом, 10% нормальной человеческой сыворотки (NHS), 10 мМ HEPES рН 7,2, пенициллин / стрептомицин, и Fungizone. Тарелка на 60 мм чашки Петри. Для исследователей, пытающихся сформировать β клеток, добавить HGF (10 нг / мл конечная) в средствах массовой информации. Кроме того, количество групп продемонстрировали, что дополнение питательных сред с инкретин гормона GLP-1 также увеличивает β элементов 28. Клетки должны быть оставлены в виде суспензии в течение 72 часов к агрегации и образуют МКК. После 72 ч в суспензии, клетки могут быть покрыты на матрице человеческой клеточной линии HTB9 матрицы, как описано выше 29. Независимо от условий роста, средства массовой информации должны быть изменены каждые 48 час. 2. Иммунофлуоресценции Маркеры эндокринной клеточной пролиферации и созревания в ИКЦ выращивают в суспензии, однослойная, или на покровные стекла Для измерения пролиферации клеток, BrdU маркировки либо прикрепленных клеток или клеток в суспензии выполняется в течение 12 ч до PFA фиксации. BrdU реагент разводили 1:100 и фильтр стерилизуют в RPMI-1640, Glutamax, 10% NHS, 10 мМ HEPES рН 7,0, пенициллин / стрептомицин, и фунгизона. Для клеток в суспензии: Центрифуга в течение 5 мин при 300 х г и аспирации культуральной среде. Добавить 10 мл PBS мыть МКК, центрифуги в течение 5 мин при 300 мкг и аспирации. Если МКК будут помещены в парафин, пожалуйста, следуйте факультативного протокола 3.1-3.17 Для прикрепленных клеток:. Удалить культуральной среды и промыть клетки с PBS, как описано выше. Fix клетки в течение 20 мин с 4% PFA при комнатной температуре, затем промыть дважды PBS. В этот момент, пластины могут быть обернуты с Parafilm и хранили в PBS при 4 ° С в течение 1 недели. Инкубируйте клетки с 0,2% Triton-X 100 в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре. Вымойте клетки дважды PBS и применять блокирующего буфера (2% делаютNkey сыворотки, 2% бычий сывороточный альбумин, 50 мМ глицин разводили в PBS) в течение 1 часа. Вымойте клетки с Рабочей буфера (Блокирующий буфер разводили 1:10). Развести антитела в рабочий буфер. Для клеток, выращенных на покровных стеклах, разбавленные антитела в 60 мкл общего объема. Для клеток в чашке 6-луночный, разбавленные антитела в 600 мкл общего объема. Чтобы окрасить множественные эпитопы, коктейль антител могут быть применены. В качестве контроля используют IgG или предварительно иммунную сыворотку вместо специфического антитела. Контрольные образцы должны быть инкубировали с IgG управления от того же вида, как первичное антитело используется. Инкубировать первичное антитело или 1,5 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Аспирируйте первичного антитела и промыть 3 раза с Рабочей буфера при комнатной температуре. Развести вторичного антитела 1:200 для родамина и FITC сопряженных антител, 1:500 – 1:1000 для Alexa сопряженных антител. Важно отметить, что все вторичные антитела к свету. Обложка образцыв алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить потерю сигнала. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Для визуализации ядер, DAPI могут быть добавлены в 1:500 во вторичном инкубации. Это полезно для количественного определения экспрессии белка в общей популяции клеток. Аспирируйте вторичного антитела и промыть 3 раза с Рабочей буфера при комнатной температуре. Для клеток, выращенных на покровное, осторожно поднимите покровное щипцами при погружении в буфере; помойте его погружения в PBS. Для клеток, выращенных в 6-луночный планшет, добавить PBS мыть и аспирации. В этот момент они готовы рассмотреть под инвертированным микроскопом. Прикоснитесь к краю покровного стекла аккуратно на Kimwipe, чтобы избавиться от лишнего PBS. Добавить каплю монтажа геля на предметное стекло и инвертировать покровное на слайде. Удалите излишки монтажной гель стремлением. Нажмите покровное осторожно задней оконечности 200 мкл пипетки для удаления пузырьков. Высушивают при комнатной температуре в течение примерно 20 мин или O / N при 4 ° С и исследовать под FLлюминесцентных или конфокальной микроскопии. 3. (Необязательно) Иммунофлуоресцентное Окрашивание белков из парафин ККО Подготовьте 3% раствор агарозы и дайте остыть до 55-60 ° C. Передача ККО инкубировали в суспензии в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 1500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте СМИ из клеток и исправить с 500 мкл 4% PFA в течение 10 мин при комнатной температуре. Не следует смешивать осадок, если осадок не очень велика. Вымойте гранул в два раза с 750 мкл PBS. Как 4% PFA, эти отходы считаются опасными и должны быть утилизированы в соответствии с требованиями опасных отходов вашей организации. Осторожно вылить осадок клеток, чтобы ослабить и добавить 150-200 мкл агарозы вниз по стенке 15 мл коническую пробирку. Смешать, осторожно слегка ударяя по пробирке, но не образуют пузыри. Дать застыть при 4 ° С в течение 5-10 мин. Используйте 21 G иглу, чтобы выбитьосадок и место в свежем 15 мл коническую трубку. Парафин вложение и подготовка участков на слайдах можно сделать на сайте, используя микротома или ваших основных микроскопии объектов. Deparaffinize ткани, гидрат, и промывают водой быстро. Добавить 0,2 М глицин в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы погасить остаточного альдегида. Вымойте слайд дважды PBS в течение 2 мин каждый. Для поиска антигена, принести 10 ммоль цитратного буфера (рН 6,0) до кипения на горячую тарелку. Погрузитесь слайды в буфере, ждать его, чтобы вернуться до кипения, и ждать в течение 15 мин. Снимите стакан с плитой. Подождите примерно 40 минут для горок для охлаждения в буфере. Вымойте слайдов дважды H 2 O в течение 5 мин каждый, мыть слайды дважды PBS в течение 5 мин каждый, блок с 2% нормальной осла сыворотки в PBS в течение 1 часа. Инкубировать с первичным антителом, разведенным в правильной концентрации в рабочей буфере, содержащем 0,2% Тритон Х-100.Как правило, первичное антитело инкубировали в течение ночи при окрашивания для факторов транскрипции и в течение 1,5 ч при окрашивания для гормонов, маркеров пролиферации и / или дифференцировки. Выполните шаги 2,3-2,9, описанные выше.

Representative Results

Тщательная подготовка плода ККО имеет решающее значение для успеха этого протокола. Представительства фотографии как клетки обычно смотрят на определенные периоды после покрытия показаны на рисунке 2. После очистки недавно покрытием сотовые заполнители выглядят как маленькие, редкие ясные кластеры, которые содержат несколько клеток (рис. 2а). После первого 24 часов (рис. 2В), многие из клеточных скоплений становятся больше, но многочисленные небольшие кластеры остаются. По 48 часов, кластеры значительно расширили, но остаются асимметричными (рис. 2С). В 72 часов, то МКК должны быть четкими, относительно однородным по размеру и форме (рис. 2D). Именно в этот момент, что клетки могут быть либо высевали на матриц, таких как HTB-9, в течение 24 ч до иммунофлюоресценции или оставляли расти в течение еще 72 ч в отсутствие или в присутствии химических веществ или препаратов, которые могут изменить экспрессию генов требуется для поджелудочной эндокринной клетки гeneration. Рисунок 3 приводится ряд часто используемых антител для оценки либо распространение ICC или дифференциацию к поджелудочной энтодермы. На фиг.3А, МКК высевали на HTB-9, выращивают в течение 4 дней, и окрашивают в течение PDX1, критической маркера рака поджелудочной развития. Хотя окрашивание в пробирке ККО выполняется регулярно в нашей лаборатории, чаще всего, МКК плода человека пересаживают под почечную капсулу голых мышей и позволили размножаться и дифференцироваться в естественных условиях 6,9,30-32. В определенные моменты времени после трансплантации мышей забивают и почки, содержащий трансплантированные ICCS удалена, фиксировали в 4% параформальдегид, и заливали в парафин. Последовательные разделы 5-мкм формируются либо на сайт с помощью микротома или с помощью микроскопии объекта основного. Эпитоп разоблачение и окрашивание белков из парафин ткани для иммунофлуоресцентного микроскопии описана в факультативного протокола 3.10-3.. 17 на рисунке 3b, пересаженные МКК окрашивали эпителиальной клетки маркером пан цитокератина (PanCK, зеленый) и с Ki67 (красный) для оценки пролиферации клеток. В другом примере, как человеческий инсулин (зеленый) и глюкагон (красный) были обнаружены после трансплантации и созревания под почечную капсулу голой мыши (фиг.3С). Рисунок 1. Блок-схема плода подготовки человека ICC и окрашивания для иммунофлуоресценции. Рисунок 2. Представитель плода подготовка МКК на 0, 24, 48, или 72 часа после посева (A) МКК.в суспензии отображаемого немедленно после посева, (B) 24 ч после посева, (С) 48 часа после посева, или (г) 72 ч после посева. Шкала бар для переменного тока, 10X увеличение = 300 мкм, масштабная линейка для D, 20 увеличение = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. .. Рисунок 3 Иммунофлуоресценции металлизированными ККО Регулярно, МКК изображаются для (А) в поджелудочной эндодерму маркера PDX1 (зеленый), (B) эндокринные клетки (пан-CK; зеленый) и распространение (Ki67; красный), (С) к инсулину (зеленый) и глюкагон (красный). Шкала бар для переменного тока, 40X увеличение = 20 мкм.

Discussion

Методы, представленные здесь позволяют генерировать ICCS из эмбриональных поджелудочной железы человека и впоследствии изображение для маркеров клеточной пролиферации и поджелудочной энтодермы. Процесс человеческого плода поджелудочной железы диссоциации требуется около 90 мин, с последующим периодом формирования МТП 72 час, подход, который существенно отличается от протоколов, чтобы изолировать β клетки клеток-предшественников из мыши. Протокол, представленные здесь обеспечивает воспроизводимый метод, который позволяет исследователю изучить плода поджелудочной развития человеческого потенциала. Два различных типа продольных исследований может быть выполнена. Во-первых, потенциал для создания функциональных поджелудочной типы клеток (протоков клетки, экзокринных клеток и гормонов положительных клеток) из разных сроках беременности может быть оценена после трансплантации. Во-вторых, МКК от одного гестационном возрасте могут быть выращены в культуре, обрабатывают выбранных фармакологических агентов и пересадили в различные моменты времени в течение ICC культуры, чтобы исследовать различияв судьбу клеток. С огромным усилиям в настоящее время, направленных на чЭСК дифференциации в инсулин-продуцирующих клеток, проблемы, связанные с секрецией инсулина в ответ на физиологические стимулы вновь возрождается. Человека МКК предоставляют уникальную модельную систему для изучения этот важный аспект распространения плода клетки поджелудочной железы и β развития клеток.

Как и с любым протоколом, чтобы изолировать клетки из тканей, детали имеют решающее значение для успеха. Ряд параметров, к сожалению, за пределами контролем лабораторных персонала, выполняющего эксперимент. Две проблемы, с которыми сталкиваются этой лаборатории включают низкое качество исходного материала и доставку не-ткани поджелудочной железы. Здоровый плода ткани поджелудочной железы является фирма в разрез ножницами. Если разрезы тканей слишком легко, это признак того, что ферменты поджелудочной железы начали переваривать саму поджелудочную железу. От этого нет, к сожалению, никакого восстановления и препарат лучше отменить. Нечасто, вопытный техник удаления поджелудочной железы спутаешь разделы кишечнике для поджелудочной железы. Эти образцы будут иметь гораздо больше эластичность, чем поджелудочной железы и заметным просвет будет присутствовать. Опять же, эти образцы должны быть отброшены.

Когда выше протокол следует как описано, есть редко любые вопросы, которые возникают бросить изоляцию от этого. Несколько моментов, чтобы помнить, чтобы обеспечить плавный изоляцию включают, использовать острые ножницы для точного поджелудочной железы резки и убедиться, что не оставляют образец ткани слишком большой, чтобы переварить. Если сокращения не достаточно мала, то коллагеназы не работает эффективно, и несколько МКК формируются. С другой стороны, при использовании новой партии коллагеназы, начать с аналогичным уровнем, если МЕ (международных единиц) для пищеварения, который использовался ранее. Тем не менее, уменьшить время инкубации, чтобы обеспечить более пищеварение не происходит. Этот метод устранения неисправностей гарантирует, что этикетка МЕ не значительно отличаться от партии к баТКП.

Взятые в перспективе, этот метод для изоляции ККО плода человека относительно стандартной в данной области. Большинство лабораторий подтвердили наши выводы, что добавление HGF в средствах массовой информации помогает клеткам выжить и размножаться 33. Таким образом, мы разработали метод, чтобы изолировать ICCS человеческого плода свежий поджелудочных желез с сроках беременности, начиная с 9 до 23 недель. Клетки можно выращивать в виде монослоя или в виде суспензии для экспериментов, чтобы визуализировать поджелудочной факторы эндокринной транскрипции и человеческий инсулин.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Калифорнийского института регенеративной медицины (RB3-02266) и NIH (DK54441).

Materials

Trehalose SG Hayashibara Trehalose SG
Collagenase XI  Sigma C-9407
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 24020-117
RPMI 1640 with glutamate Life Technologies 11879020 no glucose or HEPES
Human AB Sera, Male Donors Omega Scientific HS-30
Fungizone Life Technologies 15290018
Gentamicin Solution 50 mg/ml Invitrogen 15750060
1M Hepes, pH 7.0 Life Technologies 15630080
Penicillin – Streptomycin 100X Solution Life Technologies 15070063
Glutamax Life Technologies 35050061
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Peprotech 100-39
GLP-1 Peprotech 130-08
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16000-044
Dnase Sigma DN25
Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs Spectrum Laboratory Products, Inc. D210-13
PBS Gibco 14190
16% PFA Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey Serum  Jackson ImmunoResearch 017-000-121
BrdU Life Technologies 00-0103
anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000) Sigma I2018
anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000) Sigma G2654
PDX1 (mouse monoclonal) Novus Biologicals NBP1-47910
PDX1 (goat polyclonal) AbCam 47383
PDX1 (rabbit polyclonal) AbCam 47267
AlexaFluor 546 (rabbit) Invitrogen A11010
AlexaFluor 546 (mouse) Invitrogen A11003
AlexaFluor 488 (rabbit) Invitrogen A11008
AlexaFluor 488 (mouse) Invitrogen A11001
Ki67 Lab Vision Neomarkers RM 9016-50
pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) Immunotech 2128
CK19 AbD Serotech MCA 2145
DAPI Cell Signaling 4083
HTB9 cell line ATCC 5637 see Beattie 1997 reference to generate matrix
Agarose Sigma A-6013
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuch, B. E., Ng, A. B. P., Jones, A., Turtle, J. R. Histologic differentiation of human fetal pancreatic explants transplanted into nude mice. Diabetes. 33, 1180-1187 (1984).
  2. Tuch, B. E., Grigoriou, S., Turtle, J. R. Growth and hormonal content of human fetal pancreas passaged in athymic mice. Diabetes. 35, 464-469 (1986).
  3. Hullett, D. A., Falany, J. L., Love, R. B., Butler, J. A., Sollinger, H. W. Human fetal pancreas: Potential for transplantation. Transplantation Proceedings. XIX (1), 909-910 (1987).
  4. Hullett, D. A., Bethke, K. P., Landry, A. S., Leonard, D. K., Sollinger, H. W. Successful long-term cryopreservation and transplantation of human fetal pancreas. Diabetes. 38, 448-453 (1989).
  5. Tuch, B. E. Reversal of diabetes by human fetal pancreas. Transplantation. 51, 557-562 (1991).
  6. Beattie, G. M., Lopez, A. D., Otonkoski, T., Hayek, A. Transplantation of human fetal pancreas: fresh vs. cultured fetal islets or ICCS. J Mol Med. 77, 70-73 (1999).
  7. Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
  8. Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Joglekar, S. V., Hardikar, A. A. Human fetal pancreatic insulin-producing cells proliferate in vitro. J Endocrinol. 201, 27-36 (2009).
  9. Kayali, A. G., et al. The SDF-1alpha/CXCR4 Axis is Required for Proliferation and Maturation of Human Fetal Pancreatic Endocrine Progenitor Cells. PLoS One. 7, (2012).
  10. Otonkoski, T., et al. Hepatocyte growth factor/scatter factor has insulinotropic activity in human fetal pancreatic cells. Diabetes. 43, 947-953 (1994).
  11. D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24, 1392-1401 (2006).
  12. Xu, X., et al. Endoderm and pancreatic islet lineage differentiation from human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells. 8, 96-107 (2006).
  13. Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1940-1953 (2007).
  14. Shim, J. H., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate. Diabetologia. 50, 1228-1238 (2007).
  15. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26, 443-452 (2008).
  16. Van Hoof, D., D’Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
  17. Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7, (2012).
  18. Lees, J. G., Tuch, B. E. Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny. Regen Med. 1, 327-336 (2006).
  19. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61, 2016-2029 (2012).
  20. Bai, L., Meredith, G., Tuch, B. E. Glucagon-like peptide-1 enhances production of insulin in insulin-producing cells derived from mouse embryonic stem cells. J Endocrinol. 186, 343-352 (2005).
  21. Semb, H. Definitive endoderm: a key step in coaxing human embryonic stem cells into transplantable beta-cells. Biochem Soc Trans. 36, 272-275 (2008).
  22. Van Hoof, D., Mendelsohn, A. D., Seerke, R., Desai, T. A., German, M. S. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm in patterned size-controlled clusters. Stem Cell Res. 6, 276-285 (2011).
  23. Beattie, G. M., Otonkoski, T., Lopez, A. D., Hayek, A. Maturation and function of human fetal pancreatic cells after cryopreservation. Transplantation. 56, 1340-1343 (1993).
  24. Sandler, S., et al. Tissue culture of human fetal pancreas. Effects of nicotinamide on insulin production and formation of isletlike cell clusters. Diabetes. 38 Suppl 1, 168-171 (1989).
  25. Otonkoski, T., Beattie, G. M., Cirulli, V., Mally, M. I., Hayek, A., Sharvetnick, N., Landes, R. G. . Pancreatic regeneration. , (1997).
  26. Otonkoski, T., Beattie, G. M., Mally, M. I., Ricordi, C., Hayek, A. Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells. J Clin Invest. 92, 1459-1466 (1993).
  27. Xie, R., et al. Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 224-237 (2013).
  28. Hardikar, A. A., et al. Functional maturation of fetal porcine beta-cells by glucagon-like peptide 1 and cholecystokinin. Endocrinology. 143, 3505-3514 (2002).
  29. Beattie, G. M., Cirulli, V., Lopez, A. D., Hayek, A. Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells. J Clin Endocrinol Metab. 82, 1852-1856 (1997).
  30. Beattie, G. M., et al. Trehalose: a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage. Diabetes. 46, 519-523 (1997).
  31. Hayek, A., Beattie, G. M. Experimental transplantation of human fetal and adult pancreatic islets. J Clin Endocrinol Metab. 82, 2471-2475 (1997).
  32. Otonkoski, T., Beattie, G. M., Lopez, A. D., Hayek, A. Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant. Proc. 26, 33-34 (1994).
  33. Beattie, G. M., et al. A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function. Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).

Tags

Human Fetal Pancreatic Cell ClustersInsulin Producing CellsEndocrine Precursor CellsHESCIn Vitro GenesisC-peptidePancreatic DevelopmentPancreatic EndodermPancreatic MarkersGlucagon

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lopez, A. D., Kayali, A. G., Hayek, A., King, C. C. Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters. J. Vis. Exp. (87), e50796, doi:10.3791/50796 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image