ヒト胎児膵臓細胞クラスターの単離、培養、およびイメージング

始める前に必ず注意事項： ヒト胎児の膵臓は、先天異常研究所、組織を採取し、ワシントン大学（シアトル、ワシントン州、米国）から入手した。試料の組織寄付、保管、および使用のためのインフォームドコンセントを中心によってドナーから得た。プロトコルの同意文が書面で提供され、カリフォルニア大学サンディ​​エゴ校ヒューマン研究プロテクションプログラム全体の研究（プロトコール＃081237XT）に承認された。 それは、ヒト胎児の膵臓全体手順の間、氷上で膵臓を保持する容器の両方を維持することが不可欠である。解離および消化は可能な限り高速に実行する必要があります。 ヒト胎児膵臓は膵臓の貯蔵及び輸送のためにバッファから入手したクリニックを送信します。 （RPMI-1640 +10％正常ヒト血清（NHS）、300 mMのトレハロースSG、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびファンギゾン）。 ヒト胎児膵臓の1。解剖 2.5 mg / mlの終濃度を得HBSSでRTコラゲナーゼXI 5mgを溶解する。 4℃での滅菌（オートクレーブ処理）シンチレーションバイアルおよびストアに0.22ミクロンのシリンジフィルターで溶液を濾過滅菌組織培養フードでは、2無菌ペトリ皿、無菌小さな坩堝（るつぼが使用できない場合、小さなビーカーを置換していてもよい）、滅菌ハサミとピンセットをセット。膵臓を洗浄するために1ペトリ皿に2ミリリットルのHBSSを追加します。約1ミリリットルを残して、胎児の膵臓を含むチューブから吸引液、。 HBSSずに60ミリメートルペトリ皿にピンセットで膵臓を削除します。これらの実験のために、胎児のICCは、9から23週までの妊娠年齢との新鮮な膵臓から生成されます。以前gestionational年齢で膵臓からの単離は、膵臓の大きさに困難である。プロトコルは、Pのしかし買収、23週を超えて在胎期間に適用される可能性が高いancreataこの時間以降にあるため、連邦政府（米国）の制約のために困難である。時折、胎児の膵臓は脾臓、脂肪、または元の解剖から付属の結合組織で到着。余分な組織は、肉眼で容易に見えるとプロトコルを開始する前に、膵臓から除去されるべきである。 シャーレ内の冷HBSS（〜0.5ミリリットル）の最小容量の膵臓を洗浄します。 アイスバケットに滅​​菌ピンセットと場所を使用して、小さな無菌るつぼにきれいに膵臓を移動します。を50ml遠心管用のホルダーに坩堝を置き、はさみの2対を用いて、激しく数分間膵臓スライス。 （通常2〜5分間が、時間は、組織の大きさや硬さに依存します）。テクニックをカットすることが重要です。唯一の反対のハンドルを移動する固定位置にハサミの片側を保持する。ハサミの先端はるつぼの底にくるようにしてください。小さなに膵臓を破壊するために迅速なシザー運動を続行個。組織片が小さいほど、より良いコラゲナーゼは動作します。 最大10分間、200rpmで37℃に設定したウォーターバスシェーカーでのコラゲナーゼと場所を含むバイアルにHBSS +切り刻ま膵臓の1.5ミリリットルを追加します。最初の5分の間に、より頻繁に何度もチェックしないでください。消化時間は、組織の品質に依存し、わずか6と分で十分である。粒子が小さく均一である場合、エンドポイントである。 コラゲナーゼ活性を停止するために冷たいHBSSでバイアル（10〜15 ml）を入力します。氷の上に置き、塊が10分のために解決することができます。しばしば、この時点で、いくつかの細胞死が発生し、DNAを、培地中に放出される。これは、メディア '糸'することができます。この場合には、溶液（10 mg / mlのストック）を100μlのDNaseを追加。 シンチレーションバイアル内の組織は、10分間のセトリングした最上層オフ吸引は（7〜8ミリリットル）半分よりわずかに小さく、それを出た後。 15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す、5ミリリットルのHBSSを追加。 300×gで5分間遠心分離します。 HBSSを吸引し、RPMI-1640、グルタマックス、10％正常ヒト血清（NHS）、10のHEPES pHは7.2、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびファンギゾンを含む5ミリリットル培地中の細胞を懸濁します。 60ミリメートルペトリ皿上のプレート。 β細胞を生成しようとしている研究者のため、メディアへのHGF（最終ミリリットル10 NGを/）を追加します。さらに、グループの数は、インクレチンホルモンGLP-1の培養培地を補充することも、β細胞28を増加させることを実証した。細胞はのICCを集約し、形成するために72時間、懸濁液中のままにしておきます。 29先に説明したように懸濁液中の72時間後、細胞はヒト細胞株HTB9マトリックスのマトリックス上に播種することができる。にかかわらず、成長条件の、メディアは48時間ごとに変更する必要があります。 浮遊培養のICCにおける内分泌細胞の増殖および成熟のマーカーの2。免疫蛍光、単層、あるいはガラスカバースリップ上細胞増殖を測定するために、懸濁液中の接着細胞または細胞のいずれかのBrdU標識の前PFA固定の12時間行われる。 BrdUの試薬は1:100 RPMI-1640中で滅菌フィルター、グルタマックス、10％のNHS、10mMのHEPES pH7.0の、ペニシリン/ストレプトマイシンおよびファンギゾンを希釈する。 懸濁液中の細胞の場合：300 XGと吸引培養液で5分間遠心分離する。 300 XGと吸引で5分間、遠心分離器をICCを洗うために10mlのPBSを追加します。のICCは、パラフィンに埋め込 ​​まれるようにしようとしている場合、オプションのプロトコル3.1から3.17に従ってください。 接着細胞の場合：培養液を取り出し、上記のようにPBSで細胞を洗浄。 PBSで2回洗った後、室温で4％PFAで20分間細胞を固定。この時点で、プレートをパラフィルムで包むことができ、1週間まで4℃でPBS中に保存した。 RTで10分間PBS中の0.2％トリトンX-100で細胞をインキュベートする。 2％（ないPBSで2回細胞を洗浄し、ブロッキングバッファー適用NKEY血清、2％ウシ血清アルブミン、1時間、PBS）で希釈した50mMグリシン。 （バッファは1:10に希釈ブロックする）作業バッファで細胞を洗浄。作業バッファに抗体を希釈します。カバーガラス上で培養した細胞において、60μlの総容量で抗体を希釈する。 6ウェルディッシュ内の細胞のために、600μlの総容量で抗体を希釈する。複数のエピトープを染色するために、抗体のカクテルを適用してもよい。対照として、IgGのを使用するか、特定の抗体の代わりに免疫血清を事前。対照試料は、使用されている一次抗体と同じ種からの制御IgGと共にインキュベートしなければならない。 4℃で、室温またはO / Nで1.5時間のどちらか一次抗体をインキュベート一次抗体を吸引し、室温で作業バッファで3回洗う。 アレクサ共役抗体について1:1,000 – ローダミンとFITC結合抗体について1:200、1:500で二次抗体を希釈します。これは、すべての二次抗体が軽い敏感であることに注意することが重要です。サンプルをカバーアルミホイルで信号の損失を防止する。室温で1時間インキュベートする。 オプション：核を可視化するために、DAPIは、二次インキュベーション中に1:500で添加することができる。これは全細胞集団におけるタンパク質発現の定量のために有用である。 二次抗体を吸引し、室温で作業バッファで3回洗う。バッファに浸漬しながら、カバーガラス上で培養した細胞において、静かにピンセットでカバーグラスを持ち上げる。 PBSに浸漬することによって、それを洗う。 6ウェルプレートで増殖した細胞は、PBSで洗浄し、吸引するために追加します。この時点で、彼らは倒立顕微鏡下で検査する準備が整いました。 過剰のPBSを取り除くためにキムワイプを軽くカバースリップの端をタッチします。スライドガラス上のマウントゲルのドロップを追加し、スライド上にカバースリップを反転する。吸引により過剰取り付けゲルを取り外します。気泡を除去するために200μlのピペットチップの裏で優しくカバースリップをタップします。 4℃で約20分間、又はO / Nで、室温での乾燥下で調べるとfluorescentまたは共焦点顕微鏡。 パラフィン包埋のICCからのタンパク質の3。（オプション）免疫蛍光染色 3％アガロース溶液を調製し、55〜60℃まで冷ます室温で5分間、1,500×gでの15mlコニカルチューブに懸濁液中でインキュベートしたICC、遠心分離を転送する。 細胞から培地を吸引除去し、室温で10分間、500μlの4％PFAで固定する。ペレットが非常に大きい場合を除き、ペレットを混ぜて使用しないでください。 750μlのPBSで2回ペレットを洗浄。 4％PFAと同様に、この廃棄物は、有害とみなされ、あなたの機関の有害廃棄物の仕様に従って廃棄しなければならない。 静かに15ミリリットルコニカルチューブの壁の下のアガロースの150〜200μLを緩め、追加するために、細胞ペレットをフリック。 優しくチューブをフリックで混ぜますが、気泡を形成しない。 5〜10分間、4℃で固化することができます。 取り除くために、21 G針を使用して、新鮮な15ミリリットルコニカルチューブ内のペレットと場所。 スライド上のパラフィン包埋切片の調製はミクロトームを使用してサイトにするか、コア顕微鏡施設で行うことができます。 組織、水和物を脱パラフィンし、すぐに水で洗い流してください。 残りのアルデヒドを急冷し、室温で30分間、0.2Mグリシンを追加します。 2分間ずつPBSで2回スライドを洗浄します。 抗原回復のために、ホットプレート上で沸騰する10 mMのクエン酸緩衝液（6.0）を持参。それが戻って沸騰に来るのを待ち、15分間待機し、バッファ内のスライドを浸す。 ホットプレートからビーカーを取り除きます。バッファに冷却するために、スライドは約40分待ちます。 1時間PBS中の2％正常ロバ血清でブロックし、5分間ずつPBSで2回スライドを洗浄、5分間ずつ、H 2 Oで二回スライドを洗浄します。 0.2％トリトンX-100を含むワーキングバッファー中適切な濃度に希釈した一次抗体と共にインキュベートする。ホルモン、増殖マーカー、および/または分化のために染色した場合の転写因子および1.5時間染色した場合、一般的に、一次抗体を一晩インキュベートする。 上記のステップ2.3から2.9に従ってください。