Microfluidique Capture-cyclo-réaction sur puce pour immobiliser de façon réversible de petites molécules ou structures multi-composants pour applications biocapteurs
Summary
Nous présentons une méthode pour rapide, l'immobilisation réversible de petites molécules et des ensembles de nanoparticules fonctionnalisées pour résonance plasmonique de surface (SPR) des études, utilisant séquentielle sur puce chimie de cycloaddition bioorthogonal et anticorps-antigène capture.
Abstract
Procédés d'immobilisation de surface rapide de petites molécules bioactives avec contrôle sur l'orientation et la densité d'immobilisation sont hautement souhaitable pour les applications de biocapteurs et biopuces. Dans cette étude, nous utilisons une liaison covalente bioorthogonal très efficace [4 +2] de réaction de cycloaddition entre trans-cyclooctène (TCO) et le 1,2,4,5-tétrazine (Tz) pour permettre l'immobilisation de molécules microfluidique TCO / Tz-dérivées . Nous surveillons le processus en temps réel dans des conditions d'écoulement continu à l'aide de la résonance plasmonique de surface (SPR). Pour permettre l'immobilisation réversible et d'étendre la gamme expérimentale de la surface du capteur, on combine un composant de capture d'antigène-anticorps non covalente avec la réaction de cycloaddition. En présentant alternativement TCO ou Tz fragments à la surface du capteur, plusieurs processus de capture-cyclo sont désormais possibles sur une surface de capteur pour montage et d'interaction sur puce études d'une variété de structures multi-composants. Nous illustrate cette méthode avec deux expériences différentes d'immobilisation sur une puce de biocapteur; une petite molécule qui se lie, AP1497 FK506-binding protein 12 (FKBP12), et la même petite molécule dans le cadre d'une nanoparticule fonctionnalisée situ immobilisé et dans.
Introduction
Réactions de conjugaison efficaces sont des outils précieux pour la fixation de molécules bioactives de surfaces pour une variété d'applications de la biotechnologie. Récemment, le bioorthogonal très rapide [4 +2] de réaction de cycloaddition entre trans-cyclooctène (TCO) et le 1,2,4,5-tétrazine (Tz) a été utilisé pour marquer la surface des cellules, des structures sous-cellulaires, les anticorps et les nanoparticules 1. – 7 Ici, nous utilisons la réaction [4 +2] de cyclo en combinaison avec capture antigène / anticorps (TPS / anti-GST) pour la synthèse de structures multi-composants pour résonance plasmonique de surface (SPR) analyse de l'interaction réversible sur puce et de surveiller la processus en temps réel (Figure 1). 8,9 En particulier, la stratégie de capture-cycloaddition permet la régénération de la surface en utilisant un protocole établi. 8 En conséquence, l'assemblage de surfaces de détection stables avec le contrôle de l'orientation du ligand et de la densité pour la variété de nouvelle épreuve formats est désormais possible. Utilisationcette stratégie, nous avons démontré l'immobilisation de petites molécules TCO / Tz-dérivatisés et de caractériser les taux de cycloaddition dans une variété de conditions de tampon. Nous avons choisi l'interaction connue entre FKBP12 et un AP1497 molécule qui se lie à FKBP12 10 à 12, par exemple, pour vérifier que la stratégie de capture-cycloaddition conserve la capacité de la petite molécule d'interagir avec sa cible lorsque soit lié directement à des antigènes immobilisés sur la TPS ou à des nanoparticules immobilisées (PN).
Cette méthode présente plusieurs avantages. Premièrement, l'immobilisation réversible de petites molécules sur des puces de capteur est à présent possible. Deuxièmement, TCO / Tz immobilisation de petites molécules permet également des études d'interaction sans étiquette qui renversent l'orientation des études SPR canoniques, et peut fournir une vue complémentaire d'une interaction de liaison. Troisièmement, cette méthode permet la synthèse de nanoparticules ciblées microfluidique, et l'évaluation immédiate de leur binding propriétés. Cela promet d'améliorer l'efficacité de l'évaluation ou de dépistage nanoparticules ciblées, et aussi diminuer les quantités de nanoparticules nécessaires. 13-15 Quatrièmement, cette approche permet de mesurer la cinétique de réaction des réactions de cycloaddition bioorthogonal en temps réel sous flux continu. Enfin, l'immobilisation de la chimie TCO / Tz est robuste en présence de sérum. Dans l'ensemble, nous prévoyons que cette approche polyvalente sera largement faciliter la construction de surfaces de capteurs stables pour une grande variété d'études microfluidiques avec pertinence à in vitro et dans des applications cellulaires in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode de capture-cyclo décrit ici permet rapide, immobilisation réversible de nanoparticules modifiées et de petites molécules pour à puce interaction sans étiquette et des études cinétiques. Le protocole d'immobilisation peut être réalisée en quelques minutes nécessitant <10 uM concentrations de ligands de petites molécules. En modulant la concentration de ligand et les densités d'immobilisation de temps de contact peut être étroitement contrôlée. Nos données montrent que les réacti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le financement du NIH (NHLBI contrat n ° HHSN268201000044C à RW, SH et SYS).
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
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