분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화
Summary
다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.
Abstract
TH17 세포는 17 (IL-17) 인터루킨 생산하는 것으로 확인 된 T 세포의 서브 세트 별개이며, TH1, TH2, 규제 T 세포를 포함한 다른 T 세포의 서브 세트에서 기능이 다르다. TH17 세포는 많은자가 면역 질환과 관련된 지나치게 염증 면역 반응의 중심 원인으로 등장했습니다. 이 방법에서 우리는 C57BL / 6 마우스의 비장과 림프절에서 T 림프구를 정화하고, 제어 및 TH17 유도하는 환경에서 정제 된 CD4 + T 세포를 자극한다. TH17 유발 환경은 항 CD3 및 항 CD28 항체, IL-6와 TGF-β의 존재에 자극을 포함한다. 최소 72 시간 동안 배양 한 후 37 ° C에서 최대 5 일 동안 세포는 이후 세포 계측법, qPCR에, 및 ELISA를 흐름을 통해 IL-17을 생산하는 기능을 분석하고 있습니다. TH17 분화 된 CD4 + CD25-T 세포는 또한 TH17 세포가자가 면역 및 호스트 드의 발병 및 진행에서 재생하는 역할을 규명하기 위해 이용 될 수있다범법. 또한, 별개의 쥐 녹아웃 / 질병 모델에서 CD4 + CD25-림프구의 TH17 분화는 세포의 운명의 가소성에 대한 우리의 이해에 기여할 수있다.
Introduction
CD4 + T 림프구 (T 세포) 전염성 미생물에 대한 면역 체계가 중재 방어에 중요한 역할을한다. 역으로, T 세포들은 속속들이 예컨대 제 1 형 당뇨병, 전신성 홍 반성 루푸스, 류마티스 관절염과 같은자가 면역 질환의 발병 및 진행과 연관된다. CD4 + T 림프구는 T 세포 수용체 동족 항원 / 주요 조직 적합성 복합체 II (MHCII) 분자 (TCR)의 상호 작용의 결합을 통해 활성화되고, B7.1/B7.2와 CD28 수용체의 상호 작용은 15 리간드. TCR 자극 및 CD28 동시 자극의 제공뿐만 아니라, 항원 제시 세포는 또한 이에 관련 항원에 T 림프구의 응답을 연출, T 림프구의 분화 상태를 결정 사이토킨 환경을 제공한다. 고유 병원체 / 항원 제시 세포 상호 작용은 T는 엘리에 초점을 맞춘 독특한 경로를 림프구 왜곡 별개의 사이토 카인 환경을 만들고,시작 병원체의 mination. 불행하게도, 원래 병원균을 침해 근절하기 위해 디자인 된 T 림프구의 음향 경로는 잘못 자기 조직 (15)에 대항 할 수 있습니다. 따라서, 각 별개의 CD4 + T 세포의 부분 집합의 분화 상태를 더 잘 이해 병원균의 제거 및 자기 내성 사이의 균형을 조절하는 방법에 대한 우리의 이해에 중요합니다.
TH1, TH2, 및 유도 성 조절 T 세포 분화 경로 이외에, 나이브 T 림프구는 TH17 통로 다운 사이토킨에 의해 구동 될 수있다. Th1 세포 전투 세포 내 병원체 반면에, TH2 세포는 세포 외 병원균을 제거하고, 규제 T 세포 (Tregs가)는 염증 반응 하나, (16)을 최소화; TH17 세포는 세포 외 박테리아 및 곰팡이의 제거에 중요한 역할을한다. TH17 세포는 일반적 계보 특정 전사 인자 및 IL RORγT 생산의 식으로 표시된다대식 세포와 호중구 1, 7의 활성화를 촉진-17A.
TH17 세포는 여러 가지자가 면역 질환에 연루 및 관련 설치류 모델이되었다. 예를 들어,이 IL-23 (TH17 표현형을 유지하는데 요구되는) 것으로 증명되었다 아니지만 IL-12, 실험자가 면역성 뇌염 (EAE)의 중심 범인, MS를위한 설치류 질환 모델. 그것은 이후 IL-17의 생산 감소가 EAE 방지 2, 6, 17에 상관 관계가 있음을 보였다. 더욱이, TH17 세포 관절염 및 전신성 홍 반성 루푸스 (SLE) (10), (16)을 포함하는 다른 자기 면역 질환과 관련되었다. IL-23 결핍 P19 – / – 생쥐는 TH17 세포의 매우 낮은 숫자를 가지고 표시하고, EAE뿐만 아니라 개발에 저항했지만, 콜라겐 유도 관절염, 류마티스 관절염 10, 18 모델. 또, 마우스 후미 IL-17A의 중화 항체로 처리ER 콜라겐 – 유도 관절염의 발병은 또한 관절 손상 (18)의 해상도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이는 최근의 연구는 또한, 제 1 형 당뇨병으로 15, 11, 장내 염증 14 TH17 세포의 보호 역할을 나타낸 것처럼 면역 질환의 진행에 TH17 세포의 역할은 특성화 될 남아 있음을 주목해야한다. 이러한 연구는자가 면역에 TH17 차별화의 중요성을 확인합니다.
1) 정확히 어떻게 IL-6는 Treg의와 TH17 분화 사이의 균형을 조절 않으며, 2) 정확한 메커니즘은 무엇입니까 : 추가 조사가 필요 적어도 두 곤혹 질문이 있기 때문에 체외 TH17의 분화 T 세포 연구에 필요한 방법은 IL-17에 의한 염증성 질환 뒤에? 우리의 방법은 C57BL / 6 마우스의 비장 및 림프절에서 CD4 + CD25-T 세포를 이용한다. 그것은주의하는 것이 중요합니다 그것은 불순한를 사용 TH17 분화를 유도 할 수 있지만인구는 80 %의 순수한 CD4 + CD25-T 세포 인구를 획득하는 것은 오염의 걱정을 부정하고 성공 TH17 분화의 결과를 보장합니다. 적절한 TH17 감별을 달성하기 위하여, CD4 + CD25-T 세포는 각각 항-CD3 및 항-CD28, 활성화 신호를 제공하고, 1 및 2의 존재하에 배양하고, IL-06과 TGF-β. 이 IL-23 단독는 TH17 분화를 달성하는 데 사용될 수 있다고보고되었지만, 나중에 IL-23 TH17 세포군의 안정성 필요하다고 입증되었지만, IL-6, TGF-β는 TH17 분화에 필수적인 3, 18, 19. 쥐의 연구는 IL-23 수용체가 IL-6와 TGF-β 13, 18로 자극 된 후에 만 CD4 + T 세포에 발현되는 것으로 나타났습니다. 또한, TH17 세포가 성공적으로 한 IL-6와 TGF-β는 18, 19 존재로 IL-23-차단 항체의 존재에 개발할 것입니다. 이와 같이,이 TH17 분화 프로토콜 prov에성공적으로 TH17의 분화를 유도 할 수있는 적절한 조건을 십오. 자가 면역 질환 13을 목표로 더 나은 치료제의 개발을위한 기회를 제공 TH17 차별화와 IL-17 생산을 기본 메커니즘에 대한 이해의 개발.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 체외 TH17 차별화를 달성하기 위해 프로토콜을 설명했다. T의 분화가 인간의 병원균 (13)의 효과적인 제거를위한 중요 TH17 하위 집합으로 림프구로 TH17 분화 연구는 중요하다. 반대로, IL17의 생산은자가 면역 질환의 진행 (13)와 연결되어 있습니다. 이 면역 조절 및자가 면역의 수많은 별개의 뮤린 모델에 적용 할 수 TH17 분화의 방법은 많은 연구의 설정에 적용 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 플로리다 TL1 TR000066 및 UL1 TR000064, 건강의 국립 연구소, BD Biosciences는 시약 부여에서 부모 그랜트 R01AI056152에서 다양성 보충 대학에 NIH / NCATS 임상과 번역 상 과학 포상 및 대학에 의해 부분적으로 지원됩니다 플로리다.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3″ x 1″1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-MercaptoEthanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad |
References
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