Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

Evan L. Pannkuk; Thomas S. Risch; Brett J. Savary

doi:10.3791/50757

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

화학

Profilering de triacylglyceride Inhoud in Bat Integumentary Lipids door preparatieve Dunnelaagchromatografie en MALDI-TOF massaspectrometrie

Published: September 05, 2013

doi:

10.3791/50757

Evan L. Pannkuk¹, Thomas S. Risch², Brett J. Savary³

¹Graduate Program of Environmental Science,Arkansas State University, ²Department of Biological Sciences,Arkansas State University, ³Arkansas Biosciences Institute and College of Agriculture and Technology,Arkansas State University

Summary

Zoogdieren omhulsel bevat oplosmiddel-extraheerbare lipiden die chemische samenstelling kenmerkend is voor individuele soorten kan bieden. Dit document presenteert een routinemethode voor het scheiden brede lipideklassen Integumentair geïsoleerd uit weefsels met behulp van dunnelaagchromatografie en waarin de triacylglyceride profiel door matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie.

Abstract

De zoogdieren integument bevat talgklieren die een olieachtige stof afscheiden op het huidoppervlak. Talgproductie is onderdeel van het aangeboren immuunsysteem dat beschermend tegen pathogene microben. Abnormale talgproductie en chemische samenstelling ook een klinisch symptoom van bepaalde huidziekten. Talg bevat een complex mengsel van lipiden, zoals triacylglyceriden, die soortspecifiek. De brede chemische eigenschappen vertoond door diverse lipideklassen belemmeren de specifieke bepaling van talg samenstelling. Analysetechnieken voor lipiden vergen doorgaans chemische derivatiseringen dat arbeidsintensieve en stijging monstervoorbereiding kosten. Dit document beschrijft hoe om lipiden te extraheren uit zoogdieren integument, aparte brede lipideklassen door dunne-laag chromatografie, en het profiel van de inhoud triacylglyceride behulp van matrix-assisted laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie. Deze robuuste methode maakt een directe bepalingvan de triacylglyceride profielen tussen soorten en individuen, en kan gemakkelijk worden toegepast op elke taxonomische groep van zoogdieren.

Introduction

Zoogdieren integumentary weefsels onder de opperhuid, verhoornde structuren (bv. haar en nagels) en exocriene klieren. Talg type exocriene klieren zijn geassocieerd met haarfollikels, die collectief worden aangeduid als de talgklieruitvoergang ^1. Talgklieren laat een olieachtige afscheiding op het huidoppervlak aangeduid als talg. Talg is grotendeels samengesteld uit glycerolipids (bijv. triacylglyceriden [TAG]), vrije vetzuren acyls (FFAs), sterol / wasesters, en squaleen. Talg de chemische samenstelling is soortspecifiek ^2. Naast het feit dat een deel van het aangeboren immuunsysteem en het verstrekken van antimicrobiële functie ^3, talglipiden beïnvloeden belangrijke fysiologische processen waaronder waterverlies door verdamping via de huid ^4, cellulaire integriteit en genregulatie ^5, en absorptie ^6. Sebaceous lipidesamenstellingen kan ook dienen als ziektemarkers. Veranderde verhoudingen en hoeveelheden talg bweg lipide klassen zijn klinische symptomen van ziekten zoals acne vulgaris ^{7, 8} roos, seborrheic dermatitis ^8, asteatosis ^9, onder anderen ^10. Epidermale en haar weefsels bevatten variabele profielen met sterolen en derivaten, markeringen, FFAs, ceramiden, fosfolipiden, en andere kleine lipide componenten. Omdat integumentary lipiden kunnen functioneren ziekteprocessen bepalen verschillen in chemische samenstellingen van TAGs tussen gezonde en zieke individuen bruikbaar zijn voor klinische diagnose van ziekte.

Lipiden worden in het algemeen gedefinieerd als zijnde niet in water oplosbare organische verbindingen met ofwel niet-polaire of apolaire-polaire substituenten ^11. Lipide structuren kunnen lange koolwaterstofketens, geoxygeneerde alkanen (zoals wax esters, FFAs, alcoholen, ketonen en aldehyden), of complexe ringstructuren zoals cholesterol ^12. Er zijn acht grote klassen van lipiden basis van de structuur (FFAs, glycerolipids [GL] glycerophospholipids [GP], sfingolipiden [SP], sterol lipiden [ST], prenol lipiden [PR] saccharolipids [SL] en polyketiden [PK]), die een groot aantal chemische eigenschappen vertonen afhankelijk klasse ^13. Vanwege de grote variatie in de chemische eigenschappen van lipide klassen, wordt direct profilering zonder voorafgaande derivatisering van vetmoleculen gewenst. Een opkomende werkwijze lipide activiteit is dunnelaagchromatografie (TLC) gecombineerd met matrix-assisted laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) ^14.

MALDI-TOF MS wordt veelvuldig gebruikt in proteomics onderzoek om eiwitten te identificeren en koppelen aan specifieke aminozuursequenties vanwege de zeer nauwkeurige peptide ion mass "fingerprints" gegenereerd door trypsine-gedigereerde eiwitten ^15. MALDI-TOF MS kan ook worden gebruikt om andere biomolecuul klassen, waaronder lipiden zoals TAG ^16-18 profileren. MALDI vereist het gebruik van een matrix, typtisch een organische verbinding die aromatische en geconjugeerde dubbele binding structuren bevat. De matrix moleculen dienen voorzichtig overdracht van de energie van de laser om de analyten, bevorderen protonenoverdracht en produceren enkelvoudig geladen gasfase ionen ^19-21. Ionen worden onderworpen aan een hoge spanning veld onder hoog vacuüm en versneld in een TOF massa-analysator wanneer ionen vervolgens gescheiden door verschillen in snelheden die evenredig is met hun massa-tot-lading verhoudingen. Zelfs zeer grote biomoleculen kunnen worden geïoniseerd met weinig fragmentatie, het produceren van enkelvoudig geladen moleculaire ion soorten vereenvoudigde spectrum analyse. De mogelijkheid om vetmoleculen direct analyseren zonder voorafgaande derivaatvorming heeft bevorderd klaar goedkeuring van MALDI-TOF MS in lipidomic onderzoek ^18.

Dit document presenteert een routine methode te isoleren en analyseren Integumentair lipiden uit het haar, de talgafscheiding en plagiopatagium van de Oost-rode vleermuis (Lasiurus Borealis). Dit wordt gebruikt om interspecifieke variaties in bat Integumentair lipiden bepalen om het ziekteproces van Wit-Nose Syndrome (WNS) ²² toe te lichten. WNS is een schimmelziekte van knuppels en wordt veroorzaakt door de nieuw beschreven psychrofiele soorten Geomyces destructans ^23-25. WNS heeft de dood van meer dan 5 miljoen Noord-Amerikaanse grot vleermuizen veroorzaakt en bedreigt het uitsterven van kwetsbare soorten vleermuizen, met potentiële economische effecten van miljarden dollars aan schade aan de agrarische industrie ^26,27. Om de stappen in G. onderzoeken destructans infectie werden lipiden geëxtraheerd uit het haar en vleugel weefsels van Oost rode vleermuizen en gescheiden in brede lipideklassen door TLC aan de TAG fractie voor verdere analyse door MALDI-TOF MS isoleren. Tags bevatten korte acylketens en zijn gemakkelijk gedetecteerd door MALDI-TOF MS met weinig matrix interferentie.

Protocol

LET OP: Haal vooraf alle nodige staats-en federale vergunningen voor het hanteren, transporteren en opslaan van vleermuizen. Goedkeuringen moeten ook worden verkregen bij uw institutionele Animal Care en gebruik Comite, evenals van uw institutionele bioveiligheid commissie. Als levende vleermuizen (of zenuwstelsel weefsel) moeten worden behandeld, moeten dierverzorgers worden gevaccineerd tegen hondsdolheid. Vleermuizen die in de huidige studie werden verzameld uit de Ozark St. Francis National Forest, AR, tijdens de zomer van 2010 volgens standaard werkwijzen (Arkansas State University Institutional bioveiligheid Comite goedkeuring # 135349-1) 28. 1. Tissue Behandeling en vetextractie Reinig alle instrumenten met methanol voor en tussen weefsel verzameling van verschillende individuen. Haar te trimmen (ongeveer 1,0 g) van de huid met een schaar en plaats in een 125 ml erlenmeyer. Monster talg uit vleugeloppervlak door schrobben huid met 4-6 watten bevochtigd met chloroform: Methanol oplosmiddel (C: M; 03:02 v / v), en plaats deze in een aparte kolf. Extraheer weefsel met 10 ml C: M (02:01 v / v) dat 0,5% gebutyleerd hydroxytolueen (BHT) om oxidatie 29 te voorkomen. Gebruik alleen HPLC kwaliteit oplosmiddelen. Na 2 uur, voeg ongeveer 0,5 g watervrij sulfaat aan elke kolf, meng kort en laat het oplosmiddel door filtreren door filtreerpapier. Herhaal de stappen 1.2 en 1.3 twee keer. Eenmaal met 1:1 C: M en sequentieel met 1:02 C: M. Pool filtraten samen. Damp de samengevoegde filtraten onder een stroom N2, bepalen droog gewicht, en los het residu op in lipide 03:02 C: M (met 0,5% BHT) tot een concentratie van 10 mg / ml. Store monster in glazen flesjes bij -20 ° C. Het is over het algemeen het beste om te analyseren binnen een maand na de monsterneming en vries-dooi cycli te minimaliseren. 2. Lipide Scheiden door preparatieve dunnelaagchromatografie Bereiden op voorhand-oplosmiddel gewassen 1,5 ml microcentrifuge buizen door het vullen met 3:02 C: M, spoelen met aceton en drogen aan de lucht. Dit wordt gedaan om weekmakers die kunnen interfereren met latere massaspectrometrie verwijderen. Slaan monster buizen in een stofvrije container en omgaan met deze buisjes alleen met handschoenen om besmetting te voorkomen van de huid oliën. Activeer de TLC-plaat door eerst pre-ontwikkeling van het met 3:02 C: M. Voeg genoeg oplosmiddel om het TLC, tot een hoogte van 1 cm, plaats dan plaat in de kamer (dicht met glazen deksel) en laat het oplosmiddel helemaal rennen naar de bovenkant van de plaat. Dit duurt ongeveer 45 minuten. Verwijder de plaat en droog in een zuurkast tot oplosmiddel verdampt (ongeveer 15 minuten), daarna in een oven gedurende ten minste 10 minuten bij 120 ° C. Plaats een potloodteken bovenaan de plaat positie te houden wanneer bemonsteringen. Plaats een rechte lijn potlood, 1,5 cm van de onderkant van de plaat naar de basislijn waar het monster en standaard wordt geplaatst markeren. Bereid TLC kamer door het snijden van eenstuk filterpapier groot genoeg om de twee korte muren voeren en een lange muur. Breng het filter liner in de kamer. Het zal volledig nat als oplosmiddel wordt toegevoegd aan de kamer. Bereiding van 100 ml van de mobiele fase oplosmiddel, hetgeen hexaan: diethyl ether: azijnzuur (H: E:; 80:20:2 v / v / v). Giet oplosmiddel in de kamer tot een diepte van ongeveer 1 cm geven. Bedek met de glazen deksel, met een siliconenvet afdichting aan de bovenkant van de kamer. Laat de kamer 's nachts in evenwicht voor gebruik. Handmatig Breng het monster op de geprepareerde plaat met een capillair pipet of als een continue strook van ongeveer 1,5 cm van de rand tot 1,5 cm aan de andere rand. Een geautomatiseerde monsterdrager wordt de voorkeur omdat het monster in een homogenere reeks wordt geladen. Gebruik de buitenste rijstroken van TLC-plaat te spotten ongeveer 20 ui mengsel van sterolen, FFAs, labels en sterolester normen (gebruik bij 10 mg / ml; premade mengsels kan worden verkregen). Plaats de geladen TLC plaat inde geëquilibreerde kamer, dicht bij het deksel, en ontwikkel de plaat totdat het oplosmiddel loopt tot de bovenrand. Dit duurt ongeveer 45 minuten met de mobiele fase beschreven. Verwijder de plaat uit de kamer en laat het overtollige drogen eerst aan de plaat in een zuurkast voor ongeveer 1 minuut. Spray met 0,05% rhodamine 6G in 95% ethanol. Visualiseer lipide banden onder een lange golflengte ultraviolet lamp. Markeer met een potlood de Rf positie voor de fluorescerende banden opgelost in de steekproef en normen. Een fotografisch record kan worden genomen op dit punt. Identificeer de band die overeenkomt met de TAG standaard en verwijder deze uit de plaat door het afschrapen van de silica met een spatel op een groot stuk van pergamijn wegen papier. Breng silica 1,5 ml oplosmiddel gewassen microcentrifugebuis. Voeg 1,0 ml van 03:02 C: M oplosmiddel om het monsterbuisje ultrasone trillingen gedurende 1 min, pellet het silica door centrifugatie en vervolgens over het oplosmiddel in een nieuwe vooraf gewogen buizen. Herhaal the vorige stap, bundelen de filtraten en damp het oplosmiddel onder een stroom N2. Bewaar de gedroogde residu bevattende links onder N2 in het donker bij 4 ° C onder andere weefselmonsters worden gescheiden door TLC. Rhodamine 6G aanwezig in monsters, maar is onoplosbaar in hexaan en gedurende monster oplossen onmiddellijk voor MS analyse verwijderd. 3. TAG Analyse met MALDI-TOF MS Bereid een nieuwe α-cyaan-4-hydroxy-kaneelzuur (CHCA) matrix oplossing door het oplossen van 10 mg CHCA in 1 ml oplosmiddel (49,5% ethanol, 49,5% acetonitril en 1% waterige 0,1% TFA). Bereid adrenocarticotropic hormoon (ACTH, 18-39 clip, 2465,1989 Da) toegezonden instrument gevoeligheidstesten door mengen van 1 pl van ACTH (1 mg / ml) met 39,5 gl 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) tot een 10 pmol / ul vinden stamoplossing. Dit kan worden opgeslagen bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. Bereid een verse werkende ACTH solution (1 pmol / pl) door middel van 1 pi van 10 pmol / pl voorraadoplossing, mengen met 9 pl 0,1% TFA, en vervolgens mengen (01:01) met 10 ul van de matrix CHCA oplossing in een 500 fmol vinden / pl concentratie. Bereid TAG normen bij 10 mg / ml in 03:02 C: M voor MALDI kalibratie (bijv. tricaprine [470,361 Da], tricapryline [554,455 Da], trilaurine [638,549 Da], tripalmitine [722,642 Da], tripalmitolein [800,689 Da] , trimyristine [806,736 Da], trioleïne [884,783 Da], tri-11-eicosenoin [968,877 Da], en trierucin [1052,971 Da]). Bereid trioleïne bij 10 mg / ml in 03:02 C: M voor een externe lock mass ijking TAG standaard. Los de opgeslagen TAG monsters in hexaan om 10 mg / ml oplossing. Bereid een 0,5 M (77,06 mg/1.0 ml) stock oplossing van 2,5-dihydroxybenzoëzuur (DHB) met 90% methanol voor gebruik als monster en de standaard matrix. Eveneens een 1,0 M (2,0 g/50.0 ml) oplossing van NaOH. Bedek de buis met DHB oplossing met behulp van aluminium foi l ter bescherming tegen licht. Mix (in voorgewassen buizen) 10,0 ul DHB matrix, 10,0 ul monster of standaard, en 5,0 pi 1,0 M NaOH. Mix en kort centrifugeren de buis mengsel naar de bodem te brengen. Spot 1.0 pl standaard, monster, of ACTH op een MALDI roestvrijstalen doel bord en plaats in een exsiccator tot het droog is. Plaats de doelgroep plaat in het instrument voor data-acquisitie. Voer MALDI-TOF MS-analyses in positieve reflectron modus. Tune en het instrument kalibreren, zoals beschreven door de fabrikant van het instrument met behulp van de ACTH en TAG standaardoplossingen. Verwerven spectra voor elk monster gespot op het richtmerk (consistent met instrument specificaties; parameters voor dit werk waren 5 Hz laser vuursnelheid, ~ 100 schoten per spot met een gemiddelde spectrum te verkrijgen). Na het glad maken en het aftrekken van de achtergrond van MALDI spectra, proces ion pieken handmatig met de online zoekmachine LIPID KAARTEN (/ Tools / ms / glycerolipids_batch "target =" _blank "> www.lipidmaps.org / tools / ms / glycerolipids_batch). Kopieer en plak de lijst spectra in de lijst van precursorionen en intensiteit doos. Beperken tot acylsamenstelling gewenst. Identificeer TAGs met de massa / lading (m / z) verhouding van ionen in het spectrum voor elk monster. Als vetzure methylester (FAME) percentages zijn verkrijgbaar bij afzonderlijke GC / MS analyse, moeten deze gegevens aan waarschijnlijkheid van aanwezige TAGs vinden. INSTRUMENT: De massaspectrometer gebruikt in deze studie een Waters MALDI Micro MX (uitgerust met een 337 nm 20 Hz N2 laser). Elke fabrikant MALDI instrument met positieve reflectron modus capaciteit kan worden gebruikt. Algemene instellingen gebruikt zijn impulsspanning, 2000 V; reflectron, 5200 V; bron, 15000 V, met data-acquisitie met behulp MassLynx software (versie 4.0). Deze operationele voorwaarden te scheppen massa resolutie van meer dan 12.000.

Representative Results

De extractiemethode voor het isoleren van lipiden uit weefselkweek beschreven door Folch 30 is een eenvoudige procedure, die hier geschikt. Na weefsel extractie en verdamping van het oplosmiddel, de lipiden vaak als een gelige film. De gele kleur waarschijnlijk is uit eiwitten verontreinigingen, die kan worden verwijderd door het uitvoeren van een vloeistof-vloeistof extractie. Deze extra monster verwerking is niet noodzakelijk in deze procedure omdat preparatieve TLC scheidt de TAG fractie uit dergelijke verontreinigingen. De toevoeging van verse watervrij natriumsulfaat in alle fasen filtering helpt waterverontreiniging die nauwkeurige vetgewicht bepalingen beïnvloedt. Zoogdieren integumentary lipide-analyses door preparatieve TLC met H: E: als de mobiele fase zal verdwijnen doorgaans vier verschillende banden die overeenkomen met (vanaf oorsprong) sterolen, FFAs, labels en sterolesters / wasesters / squaleen (figuur 1). Af en toe bij het gebruik van analytischecal high performance (HP) TLC met de H: E: Een mobiele fase, de sterolesters, wasachtige esters, en squaleen zal scheiden en verschijnen als drie afzonderlijke banden. Onder de in de onderhavige studie voorwaarden worden de sterol / wasachtige esters niet gescheiden. Als deze banden van belang, kan de mobiele fase worden geschakeld isooctaan: ethylether (95:5 v / v), en HPTLC plaat kan worden geanalyseerd met scanning densitometrie. Andere factoren kunnen een slechte scheiding veroorzaken. Deze worden meestal verwijderd door het plaatsen van het filterpapier in de kamer, het toepassen van vet voor een goede afdichting op het deksel, evenwichtsherstellende de kamer 's nachts, en het houden van schoon TLC kamers, een consistente kwaliteit TLC scheidingen en gegevens te verkrijgen. Vertegenwoordiger MALDI-TOF massa spectra verkregen voor tags geïsoleerd van de Oost-rode vleermuis zijn weergegeven in de figuren 2 en 3. Deze spectra bevatten TAG ionen pieken in het massa bereik van m / z 850-910, die typisch is voor TAG geïsoleerd uit niet-aquatische zoogdiers. De toevoeging van 1,0 M NaOH bevordert enkelvoudig geladen Na + ionen die stabieler dan H + ionen zijn. Daarnaast vormt het ontbreken van H + en K + ionen verhoogt het gemak van spectrumanalyse. Het m / z 850-910 ion pieken corresponderen met 16:00, 18:00, 18:01 en 18:02 FA eenheden mag overheersen acyl bestanddelen in TAGs (tabel 1). Mogelijke FA resten van tags kunnen in eerste instantie worden bepaald door de totale ion m / z aanwezig in MALDI-TOF MS-spectra, en verschillen tussen soorten en individuen afgeleid. Indien de specifieke verhoudingen van acyl inhoud vereist, dan MS / MS of gaschromatografie (GC / MS) worden gebruikt. Meer informatie over acyl verhoudingen kunnen worden afgeleid door het observeren van de pieken in de diacylglycerides gebied van het spectrum (figuur 4). Diacylglycerides worden geproduceerd uit TAG fragmentatie in de MALDI bron en is te vinden in de m / z 590-650 regio. TAG fragmentatie kan worden verhoogdweglaten van de toevoeging van 1,0 M NaOH 16. Oost rode vleermuis vleugel weefsel wordt gekenmerkt door een dominante piek bij m / z 879,7 en haar weefsel met een dominante piek bij m / z 881,8 (figuur 2 en 3 respectievelijk). Pieken bij m / z 907,8, 879,7 en 855,7 (POP, OPE) ongeveer zelfs intensiteit (~ 50%) in het haar weefsel met de piek bij 853,7 wezen ~ 40%. Samenstelling Elementsamenstelling Waargenomen Massa Na + TAG Na + TAG SSO C 57 H 108 O 6 911,8 OOS, LSS C 57 H 106 O 6 909,8 OOO, lnss, LSO C 57 H104 O 6 907,8 LOO, LLS C 57 H 102 O 6 905,8 LLO, OOLn C 57 H 100 O 6 903,7 LLL C 57 H 98 O 6 901,7 LLLn C 57 H 96 O 6 899,7 LLnLn C 57 H 94 O 6 897,7 LnLnLn C 57 H 92 O 6 895,7 OSP C 55 H 104 O 6 883,8 LSP, OOP, Sopo C 55 H 102 O 6 881,8 LOP, LnSP, LSPO C 55 H 100 O 6 </ Td> 879,7 LLP, LNOP Lopo C 55 H 98 O 6 877,7 LnLP, LLPo, LnOPo C 55 H 96 O 6 875,7 LnLnP, LnLPo C 55 H 94 O 6 873,7 LnLnPo C 55 H 92 O 6 871,7 PPS C 53 H 102 O 6 857,8 POP, OEP C 53 H 100 O 6 855,7 OOM, PPL, Popos, Popo C 53 H 98 O 6 853,7 PPLN, ppol, Popoo, Myoo C 53 H 96 O 6 851,7 LLM, LnOM C 53 H 94 </sub> O 6 849,7 PPP, SSLa C 51 H 98 O 6 829,7 PPPo, Osla C 51 H 96 O 6 827,7 PPoPo, PMyO C 51 H 94 O 6 825,7 LnLnLa C 51 H 86 O 6 817,6 MMS, tik, PPM C 49 H 94 O 6 801,7 SLaPo, PPOM, PPMy C 49 H 92 O 6 799,7 PoPoM, OOCa C 49 H 90 O 6 797,7 MMP C 47 H 90 O 6 773,7 MMPo, OCAP C 47 H 88 O6 771,7 OCaPo C 47 H 86 O 6 769,6 MMM, PPCA, PMLA C 45 H 86 O 6 745,6 PoPCa, PoMLa C 45 H 84 O 6 743,6 Popoca C 45 H 82 O 6 741,6 Lalap, MMLa, MCAP C 43 H 82 O 6 717,6 LaLaPo C 43 H 80 O 6 715,6 OO C 39 H 72 O 5 643,5 OL C 39 H 70 O 5 641,5 LL C 39 H 68 O 5 639,5 SP C 37 H 72 O 5 619,5 OP C 37 H 70 O 5 617,5 LP C 37 H 68 O 5 615,5 Tabel 1. Vetzuursamenstelling, elementaire samenstelling en isotopische massa sodiated adducten van triacylglyceriden en diacylglycerides. Ln = linoleenzuur (18:03), L = linolzuur (18:02), O = oliezuur (18:01), S = stearinezuur (18:00), P = palmitinezuur (16:00), Po = palmitinezuur (16:01), M = myristinezuur (14:00), My = myristoleinezuur (14:01) La = laurinezuur zuur (12:00), Ca = caprinezuur (10:00). Figuur 1. Dunne-laag chromatogram van brede lipideklasse scheiding door hexaan: diethylether: azijnzuur(80:20:2 v / v / v) als mobiele fase. De band tussen sterol en FFA niet ontdekt standaard maar kan een vetalcohol of was diester zijn. Figuur 2. Uitgebreid TAG regio MALDI-TOF massa spectrum van sodiated tags. (M / z 700-950) uit Oost-rode vleermuis (L. borealis) vleugel weefsel Pieken geïdentificeerd bij m / z 853,7 (OOM, PPL, Popos, Popo) en m / z 879,7 (LOP, LnSP, LSPO). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Figuur 3. Uitgebreid TAG regio MALDI-TOF massa spectrum van sodiated TAG (m / z 700-950) uit Oost-rode vleermuis (L. borealis) haar weefsel.Pieken die bij m / z 905,8 (LOO, LLS) en m / z 907,8 (OOO, lnss, LSO). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Figuur 4. DAG regio van MALDI-TOF massa spectrum van sodiated DAG fragmenten (m / z 530-730). Uit Oost rode vleermuis (L. borealis) vleugel weefsel Pieken geïdentificeerd bij m / z 643,5 (OO) en m / z 615,5 (LP) . Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

Dit document presenteert een eenvoudige en robuuste methode voor het scheiden van brede lipideklassen geïsoleerd van zoogdieren omhulsel door preparatieve TLC en het bepalen van TAG profielen door MALDI-TOF MS, zonder tijdrovende derivatisering van de vetmoleculen. De kritische stappen in het produceren van kwaliteit spectra van TAG's met MALDI-TOF MS zijn onder andere: 1) Succesvolle extractie van de verbinding met minimale vervuiling of oxidatie, 2) Voldoende scheiding en isolatie door chromatografie, en 3) een hoge resolutie en nauwkeurigheid van massa door MALDI-TOF MS.

Deze paper toont de methode door het winnen en het scheiden van de neutrale lipide fractie uit de plagiopatagium van de Oost-rode vleermuis om TAG MS profielen te verkrijgen. Hoewel de huidige studie gebruikte een vleermuis species (Mammalia: Chiroptera) deze werkwijzen kunnen worden uitgebreid tot bedekkinglijk lipiden van elke zoogdiersoort bestuderen. Bat omhulsel wordt gekenmerkt door overwegend cholesterol, met lagere hoeveelheden TAG, FFAs, squaleen, en sterol / wasesters. Talg lipideverhoudingen in knuppels verschillen van mensen, dat squaleen aanwezig in lage bedragen (in plaats van tot 16% bij de mens), terwijl cholesterol komt in grotere verhoudingen (1 – 7% bij mensen maar 26-62% in knuppels) ^{22 , 31.} Menselijke haren bevatten ongeveer 3% TAGs, terwijl verhoudingen tot 28% gevonden in Oost rood bat haar. De extractie van lipide monsters van knuppels is vergelijkbaar voor andere soorten. Terwijl in deze studie watten gedrenkt in oplosmiddel gebruikt talg verwijderen, kan men ook zwenken flesje of monsterbuis met oplosmiddel op het oppervlak van het omhulsel meerdere keren. Gespecialiseerde tape producten bieden ook alternatieve middelen om het oppervlak lipiden halen ^32. Een belangrijk onderdeel van een goede lipide extractie is om verontreiniging van de huid olie te minimaliseren. Dit is eenvoudig te realiseren door het houden van een knijpfles met methanol en spuiten van al het glaswerk en bestek, vegen gebruiksvoorwerpen met een weefsel tussen alle monsters en het dragen van onderzoekshandschoenen. Oxidatie of polyonverzadigde acyls wordt voorkomen door de toevoeging van BHT en moet ongeacht de temperatuur monsters opgeslagen worden.

Biomolecuul analyse vereist meestal een chromatografische stap om afzonderlijke moleculen van belang tegen verontreinigingen. TLC wordt gebruikt in deze werkwijze, die instrumentatie eisen voor gas-of vloeistofchromatografie vermijdt en vereist minder technische ervaring robuuste en herhaalbare resultaten. Afhankelijk van de lipide klasse plaats kunnen vele mobiele fasen worden opgenomen. Bovendien kan het gebruik van HPTLC platen en scanning densitometrie worden gebruikt om kwantitatieve resultaten te bereiken. Hoewel variaties van TLC methoden zijn te talrijk om hier een aantal gangbare mobiele fasen gebruikt lipide TLC onder chloroform: methanol: water voor scheiding van fosfolipiden en glycolipiden of isooctaan: ethylether voor het scheiden van niet-polaire lipiden ^28. In termen van het scheiden van tags uit andere lipide klassen, de H: E: Een zolvent systeem werkt consequent en levert vergelijkbare resultaten.

Een ander voordeel voor het gebruik van TLC is dat banden van belang snel kan worden geprofileerd met behulp van MALDI-TOF MS zonder voorafgaande derivatisering van de analyten. In deze studie wordt de silica uit de TLC-plaat en de analyt geëlueerd uit door sonicatie in een oplosmiddel en daaropvolgende centrifugatie aan het adsorptiemiddel en verdamping van het eluerende oplosmiddel te scheiden. Als alternatief matrix kan direct op analyt bands gescheiden op TLC-platen en vervolgens direct geanalyseerd met MALDI-TOF MS ³³ toegepast. Succesvolle profilering door MALDI-TOF MS doet beroep op voldoende monstervoorbereiding en vaardigheid van de operator met tuning en kalibreren van het instrument. Het instrument moet dagelijks worden gekalibreerd met normen voor molecuulgewichtbereik geschikt is voor de moleculen van belang. De geschikte gevoeligheid en resolutie (bijv. ≥ 10.000) van de apparatuur moet worden confirmedagelijks d met ACTH.

De talgklieren lipide bestanddelen gevonden op het oppervlak van zoogdieren omhulsel kan een rol spelen in de kolonisatie door bacteriën / schimmels. Daarom is kennis van de chemische samenstelling tussen soorten en individuen kan aanwijzingen over processen van mens en dier ziekten. Intraspecifieke verschillen tussen zieke en gezonde mensen kunnen klinische verschijnselen vertegenwoordigen die helpen bij ziekte opsporing en diagnose. Bovendien, als specifieke verbindingen die microbiële groei remmen aanwezig zijn, kunnen deze worden geïdentificeerd voor gebruik in de behandeling van ziekten en preventie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Hulp werd geboden door Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell, Tony LaMark James, Amy Fischer, Hannah Blair, en Cheyenne Gerdes tijdens de ontwikkeling van laboratoriumtechnieken. Wij willen de Medina-Bolivar Laboratory (Luis H. Nopo-Olazabal; Arkansas Biosciences Institute) bedanken voor hulp bij TLC scanning densitometrie. MALDI-TOF MS gebruikt voor dit project werd verstrekt door de NSF EPSCoR, RII: Arkansas ASSET Initiatief P3 Center (EPS-0701890) in de Arkansas Biosciences Institute. De financiering werd verstrekt door een Amerikaanse Fisheries and Wildlife Service / Arkansas State Wildlife Grant, de Nationale Speleologische Society, en het Centrum voor Noord-Amerikaanse Bat Research and Conservation aan de Indiana State University.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Butylated Hydroxytoluene	MP Biomedicals, LLC	101162	www.mpbio.com
TLC Flexible Plates	Whatman	4410-222	www.whatman.com
ACTH	Sigma-Aldrich Chem. Co.	A8346-5X1VL	www.sigmaaldrich.com
Triolein	Sigma-Aldrich Chem. Co.	44895-U
TLC Lipid Standard		TLC 18-1	www.nu-chekprep.com
MALDI TAG Standard	Nu-Check Prep., Inc.	NIH Code 53B
MALDI TAG Standard	Sigma-Aldrich Chem. Co.	17810-1AMP-S
Glass Vials with Teflon Cap	U.S. National Scientific Co.	B7800-2	www.nationalscientific.com/
DHB	Sigma-Aldrich Chem. Co.	50862-1G-F
CHCA	Sigma-Aldrich Chem. Co.	C8982-10X10 mg
Sebutape	CuDerm	S100

References

Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland. Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).
Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals. Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).
Desbois, A. P., Smith, V. J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).
Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird. Condor. 109 (1), 59-66 (2007).
Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).
Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo. European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).
Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. Sebaceous gland lipids. Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).
Ro, B. I., Dawson, T. L. The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff. Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).
Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls. Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).
Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today’s pre-clinical data into tomorrow’s daily clinical practice. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).
Horton, H. R., Moran, L. A., et al. . Principles of Biochemistry. , (1993).
Fahy, E., Subramaniam, S., et al. A comprehensive classification system for lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).
Fahy, E., Subramaniam, S., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).
Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state. Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).
Savary, B. J., Vasu, P., Lorence, A. . Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols. , (2011).
Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).
Fuchs, B., Schiller, J. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics. European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).
Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).
Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).
Knochenmuss, R., Cole, R. B. . Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications. , 149-262 (2010).
Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption – ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI – TOF MS). Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).
Blehert, D., Hicks, A. C., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen. Science. 323 (5911), 227-228 (2009).
Gargas, A., Trest, M. T., et al. Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome. Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).
Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome. Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).
Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species. Science. 329 (5992), 679-682 (2010).
Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. The economic importance of bats in agriculture. Science. 332 (6025), 41-42 (2011).
Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research. Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).
Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy. Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).
Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
Nicolaides, N. Skin lipids: Their biochemical uniqueness. Science. 186 (4158), 19-24 (1974).
Camera, E., Ludovici, M., et al. Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).
Fuchs, B., Süß, R., et al. Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, doi:10.3791/50757 (2013).