Büyük ölçekli SNP Genotiplendirme Uygulamaları için infinium Tahlili
Summary
Bir protokol büyük ölçekli genotipleme gerçekleştirmek için Illumina'nın Infinium tahlilleri kullandığı açıklanmaktadır. Bu deneyler, güvenilir bir şekilde üç gün sonra tek tek DNA numunelerinin yüz üzerinde SNP milyonlarca genotip olabilir. Bir kere üretilen, bu genotipleri farklı hastalıklar veya fenotipleri çeşitli dernekler kontrol etmek için kullanılabilir.
Abstract
Insan genomundaki genotipleme varyantları fenotipleri ile genetik ilişkileri belirlemek için etkin bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Ailelerin veya nüfus içindeki varyantın dağılımı hastalığın genetik faktörlerin belirlenmesini kolaylaştırabilir. Genotiplemesi BeadChips bir Illumina'nın paneli araştırmacılar binlerce veya tek nükleotid polimorfizmlerinin milyonlarca (SNP) genotip veya DNA örneklerinin çok sayıda genelinde bu tür kopya sayısı gibi diğer genomik varyantlar, analiz etmeyi sağlar. Bu SNP genom boyunca yayılmış veya potansiyel keşif maksimize etmek için belirli bölgelerde hedeflenebilir. Infinium deneyi hızlı, yüksek kaliteli, doğru sonuçlar elde etmek için optimize edilmiştir. Doğru kurulum ile, tek bir teknisyen dizinin tipine bağlı olarak, haftada binden fazla DNA örnekleri için birkaç yüz işleyebilir. Bu deney, genomik DNA ile başlayan ve dizinin tarama ile biten her adımda kullanıcılara yol gösterir. Yerindelik Reage kullanmaNTS, örnekler güçlendirilir, parçalanmış, çöktürülmüş yeniden süspanse, lekeli tek bir baz tarafından genişletilmiş çip, hibritlenmiş ve bir iScan veya Hi Tarama, yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme sistemi ya taranır. Bir gece boyunca adım DNA'yı yükseltmek için gereklidir. DNA denatüre ve izotermal olarak bütün genom amplifikasyonu ile büyütülmüş, bu nedenle, hiçbir PCR gereklidir. Numuneler, bir gece boyunca, ikinci aşama sırasında diziler hibridize edilir. Üçüncü gün, numuneler taranmış ve incelenmiştir hazırdır. Çoğaltılan DNA, boncuk dizileri, böylece verim maksimize, haftanın her günü işlenecek sağlayan, büyük miktarlarda depolanmış olabilir.
Introduction
Tek nükleotid polimorfizm (SNP) yazma hastalığı ile bağlantılı risk varyantlarını tanımlayan önemli bir yöntemdir. Tarihsel olarak, genotipleme deneyler kapsamı mevcut teknoloji ile sınırlı kalmıştır. Jel elektroforez tabanlı genotiplendirme yöntemleri örnek ve SNP-throughput sınırlıdır [1]. Bu tahliller geliştirmek genellikle optimizasyonu için varyant çevreleyen bölgenin makyaj ve yapısına dayanarak, emek-yoğun olabilir [1]. Life Technologies tarafından geliştirilen TaqMan genotipleme deneyler, hızlı bir şekilde ve en az teknisyen tutulumu olan örnekler çok sayıda çalışabilir [2], fakat SNP-çoklama sınırlamaları günde de altında bir milyon [3,4 genotip için toplam sayısını sınırlamak için devam ]. Az yüz SNP birlikte çoğaltılmış olabilir gibi Sequenom en iPlex platformu ayrıca, aynı anda birçok örnekleri çalıştırmak, ancak, verimlilik genel olarak nispeten düşüktür [5]. Beckman Coulter SNP stream teknolojisiteorik olarak günde üç milyon genotipleri üretmek, ama olabilir reaksiyon başına sadece kırk sekiz SNP maksimum bu teknolojinin sınırları proje aralığı [4,6]. GoldenGate deney numune başına SNP yüzlerce veya binlerce her gün yaklaşık iki yüz DNA örnekleri işleyebilir iken bir kez [4,7 anda üç bin SNP yazarken, genotip başına fiyat gelişmiş, ultra-yüksek verimli teknikleri ile rekabet değil ]. Günde birkaç milyon genotipleri işlemek için büyük genom dernek çalışmaları için gerekli ölçek, dizi-hibridizasyon deneyleri piyasadaki en uygun maliyetli bir seçenek haline gelmiştir.
Melezleme dizilerin affymetrix hattı ve Infinium tabanlı dizileri Illumina'nın hat örneklerinin potansiyel yüzlerce paralel [4,8] içinde SNP binlerce veya milyonlarca yüzlerce yazılmasına izin. Bu SNP gibi eski gibi ilgi bölgelerde, lokalize, tüm genom çapında dağınık olabiliromes, ya da kullanıcının tercihlerine göre kişiselleştirilebiliyor. Bu diziler doğru seferde numune başına bir milyon SNP genotiplemesi için değil, aynı zamanda, potansiyel olarak açıklanması kromozom anormallikleri kopya sayısı varyasyonu ölçmek mümkün değil, sadece yarar var. Infinium hizalanmış OMNI BeadChip dizileri şu anda her gün yaklaşık yüz kadar örnek üzerinde, yarım milyon özel loci dahil numune başına yaklaşık beş milyon belirteçleri, kadar genotiplemesi için yeteneği var.
Çoğu hastalıklar genetik bir bileşeni var gibi, bu büyük ölçekli deneyler hastalığı ile ilişkili genleri bulmakta önemli olabilir. Yüksek verim genotipleme örneğinde etkili genotip üretimine olanak ikna edici bir alt ufak alel frekanslarda genetik ilişkiyi tespit etmek için yeterince büyük ayarlar. Tüm genom genotip projeler istatistiksel olarak anlamlı bir vaka-kontrol alel frekansı veya kopya sayısı farklılıkları bölgeleri bulmak için kullanılabilmektedir [9,10,11]. Ulusal İnsan Ge görenome Araştırma Enstitüsü, genom-geniş dernek çalışmaları bir p-değeri en az 1 x 10 -5 ile 8283 SNP keşfinden kaynaklanan, 25 Kasım 2008 ve 25 Ocak 2013 tarihleri arasında 1.490 ayrı yayın yol açtı (http:// bakın yükseklikten bir genom analizi ile sağladığı geniş yaklaşımdan yararlanmıştır testis kanseri kadar değişen koşulları araştırılmış www.genome.gov/gwastudies/). Bu çalışmalar,. Yazarak kapsamı çok kısıtlayıcı olmuştu bu gibi durumlarda, ilgilenilen tüm bölgeleri fark kaçmış olabilir. Büyük ölçekli dernek analizleri için Böylece, bir genom genotiplemesi tekniği tercih tekniktir.
Infinium deneyi farklı versiyonları her dizilerin belirli türleri ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır, var. Veya 24 örnek dizisi chips – Aşağıdaki ayrıntılı olarak tartışılan InfiniumUltra deneyi, bir çok 12 için uygundur. Bunlar genellikle DNA numune başına yüz bin yılı aşkın bir SNP genotip ve t odaklanmakBöyle exome veya özel paneller gibi argeted bölgeler. Diğer deney versiyonları gibi bütün genom genotipleme dizileri gibi diğer çip türleri için gerekli olabilir. Tüm deneyler, Infinium ortak bir temeli vardır ve ağırlıklı olarak sadece reaktif isimler, ayıraç hacimli ya da tam reaktif boyama işlemi ile farklılık olarak, ancak, bir deney versiyonuna mükemmel teknikleri genellikle evrensel olarak uygulanabilir. Gibi metilasyon diziler gibi diğer diziler, yanı, neredeyse özdeş protokolünü kullanabilirsiniz. Bakım çip tipi kullanım için gerekli testin sürümünü kullanmak sadece alınmalıdır. Bu tür gen ekspresyonu seviyesini ölçmek için olanlar gibi bazı türleri, bir nonInfinium protokolünün kullanılmasını gerektirebilir.
Örnekler toplu olarak işlenmelidir. Örneğin, InfiniumUltra yöntemi ile, reaktif melezleştirme borular 96 örnekleri çalıştırmak için yeterli hacim içeren ve tüpler refrozen edilemez. Bu nedenle, örnek bir seferde 96 örneklerinin gruplar halinde çalıştırılmalıdır. Numuneler köknar üzerinde amplifiye edilecektirt gün. Benchwork Yaklaşık 1 saat sonra, numuneler, 20-24 saat boyunca bir konveksiyon fırınında ısıtılmalıdır. Ertesi gün, yaklaşık 4 saat çökeltilmesi ve örnekler ileride kullanılmak üzere dondurulabilir ya da çip hibridize olabilir ya da bu noktada numune, tekrar askıda bırakılması, parçalanan harcanacak. Fiş yükleme numuneler, 16-24 saat boyunca bir gece boyunca hibridize olacak sonra, yaklaşık 2 saat sürer. Üçüncü gün, boyama ve uzatma adım ~ 4 saat sürer. Bir başka saat yıkama, kaplama ve cips kurutulması harcanacak. Son olarak, diziler kullanılan türüne bağlı olarak, 15-60 dakika / çipinden sürebilir, taranır.
Standart laboratuvar güvenliği ve temizlik önlemleri uygulayın. Amplifikasyon PCR bazlı olmasa da, ön ve postamplification işlemleri için ayrı iş istasyonları kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için gereklidir. Kullanılan her kit sağlanan ayıracı kimlik numarası izleme kağıda giriş yapmalısınız. ReageNTS dağıtma önce birkaç kez kullanımdan hemen önce çözülmüş ve ters olmalıdır. Yazılmaları için DNA, standart yöntemlerle izole edilir ve bir florometre ile nicelleştirilmiştir yüksek kaliteli bir genomik DNA (260/280 1,6-2,0 arasında emme oranı, 3.0 'ın altına ve 260/230 emme oranı) olması gerekir. DNA bozulması genellikle düşük kaliteli deney sonuçlarında katkıda bulunan bir faktördür. Bu miktar bir yonga tipleri için değişebilir ama tipik olarak, 200 ng of DNA gereklidir. A Tecan sıvı-yü protokolün birçok adımları otomatik ve bir faktör olarak insan hatası en aza indirebilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Büyük ölçekli genotiplendirme uygulamaların daha çok insan hastalıklarının altında yatan genetik mekanizmasını anlamak için kullanılmıştır. Bir genom ilişki analizi yoluyla önemli bir varyantı keşif daha fazla çalışma için bir aday bölgeyi bayrak olabilir. Buna ek olarak, genotip veri dizileme projeleri üzerinde kalite kontrol için iyi bir araçtır.
Numune hacmini en üst düzeye çıkarmak için, birden çok numune levhalar büyütülmüş ve parçalanmış, yeniden süspansiyon haline getirilmiş eyalette saklanabilir. Sekiz plakalar birden çok toplu için protokolün ilk 24 saat birleştirerek ve chip-işleme ~ 2-8 gün için yeterince malzeme sağlayan, tek bir gün içinde güçlendirilebilir. Güçlendirilmiş plakaları önceden stoklanmış, ve yeni örnekleri taramalı önceki çalışması başlar hemen sonra cips melezleşmiştir ise, işleme ek numune hazırlama için duraklama gerek olmadan sürekli çalıştırabilirsiniz. Bu nedenle olsa örnekler tam geçmesi için üç gün sürertahlil, veriler günlük oluşturulabilir. Assuming24 cips her gün işlenen, 5 günlük bir çalışma haftası 12 numune boncuk çip üzerinde çalıştırmak üzere 1000 yılı aşkın bir DNA örneklerinin sağlar. Herhangi bir adım veya reaktif başarısız olursa herhangi bir düzeltme uygulanabilir önce, ancak, birden fazla toplu kötü performans için risk altında olabilir. Diziler taranmış veya analiz edilinceye kadar hataları fark kaçış olabilir; verim maksimize bu nedenle, protokol çeşitli aşamalarında numunelerin şimdiden yüzlerce keşif üzerine aynı kusurlu tedavi almış olabilir. Kayıp reaktifler ve veri geri alınamaz gibi, kullanıcı hızlandırılmış bir iş akışı için ihtiyaç karşı bu riskleri tartmak gerekir.
GenomeStudio analiz yazılımı gerçekten genotiplendirme sürecinin başarısını ölçmek için ilk fırsattır. Norm-Teta yoğunluk araziler vs Norm-R düzgün kümelenmiş ise bu değer sli göstermekle beraber, numunelerin ortalama çağrı sayısı (toplam SNP yüzde başarıyla yazdığınız),% 99 yaklaşım gerekirghtly dizi türüne bağlı. % 85-90 daha düşük bir çağrı oranı ile herhangi bir örnek veriler güvenilir değildir ve atılmalıdır. Kalite kontrolü amacıyla, sonuçlar, daha önce mümkün olan her zaman bilinen bir genotip ile karşılaştırılmalıdır. Böyle bir veri varsa, kasıtlı örnek çoğaltılması plaka ya da dizi yerleşimleri doğrulayarak bir araçtır. Bu yinelenen çiftleri ayrı cips, levhalar, gruplar, ya da projeler üzerinde konulmalıdır; onların genotipleri üretimi üzerine kontrol etti. Belirli QC kısıtlamaları araştırmacının tercihine göre değişmekle birlikte, ortak SNP kısıtlamalar örnek çağrı başarı, Hardy-Weinberg denge, ya da vakalar ve kontroller arasındaki missingness, dayalı ortak örnek kısıtlamaları arama oranları, Mendel tutarsızlıklar veya çapraz referanslara dayalı iken Klinik cinsiyet verilerine X-kromozom heterozigosite [13].
Herhangi bir sorun ortaya çıkarsa, analiz takımında bulunan Denetimler Dashboard, teslim edilebilirnedenini belirlemek amacıyla şirket. Bu kontroller genellikle muhtemel adıma veya reaktif başarısızlık sorunu daraltmak. Ilgi herhangi bir SNP Infinium genotiplendirme deney yoluyla bulunursa, bunların yoğunluk araziler çift kontrol daha fazla araştırma yapılır önce kümeleme hataları GenomeStudio olmalıdır.
Başarısız Infinium genotiplendirme deney nedeniyle insan işleme hatası veya düşük kaliteli giriş DNA muhtemeldir. Örnek ölçümü doğru ve kesin olmalıdır. En iyi sonuçları elde etmek için, herhangi bir reaktif bir örneğe ilave veya yonga protokolü tarafından belirlenen ses seviyesinde tevzi gerekir. Pipetler düzgün kalibre edilmelidir. Reaktifler bitiminden sonra koşmak olmamalı ve bir kez eritilip tekrar dondurulmamalıdır, RA1 reaktif için kaydedin. Mümkün boyama ve uzatma hataları en aza indirmek amacıyla, formamid / EDTA kanşımı her ay yeni hazırlanmalıdır. Tüm reaktifler, -20 ° C, sadece el ile defrost dondurucu saklanmalıdır. St kullanılan tüm laboratuvarAining, protokol uzantısı ve yıkama bölümleri hemen terketmek üzerine su ve yumuşak bir deterjan ile iyice durulanmalıdır. HYB odasında nemlendirme rezervuarlar bir test tüpü fırça ve hafif bir deterjanla temizlendi olmalıdır. Haftada bir kez, kendi kullanıcı kılavuzları tarafından talimat olarak cam slaytlar,% 10 çamaşır suyu ile yıkanmalıdır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu iş için finansman NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959 ve NIH R56 AI063274 tarafından sağlanmıştır
Materials
| Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
| 0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
| Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
| Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
| Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
| Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
| Pipette tips – 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
| Pipette tips – 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
| Pipette tips – 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
| 0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
| Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
| Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
| Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
| EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
| 10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
| 200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
| 1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
| Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
| Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
| Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
| Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
| Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
| Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
| Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
| Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
| Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
| Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
| Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
| Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
| Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
| Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
| iScan or HiScan | Illumina | – | 1 |
References
- Shi, M. M. Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies. Clin. Chem. 47 (2), 164-172 (2001).
- Livak, K. J. SNP genotyping by the 5′-nuclease reaction. Methods Mol. Biol. 212, 129-148 (2003).
- Seeb, J. E., Pascal, C. E., Ramakrishnan, R., Seeb, L. W. SNP genotyping by the 5′-nuclease reaction: advances in high throughput genotyping with non-model organisms. Methods in Mol. Biol. 578, 277-292 (2009).
- Bayés, M., Gut, I. G., ed, . Overview of Genotyping. Molecular Analysis and Genome Discovery. , 1-23 (2011).
- Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-Nucleotide Polymorphisms for High-Throughput Genotyping of Anopheles arabiensis in East and Southern Africa. J. Med. Entomol. 49 (2), 307-315 (2012).
- Liu, Z. SNP Genotyping Platforms. Next generation sequencing and whole genome selection in aquaculture. , 123-132 (2011).
- Shen, R., Fan, J. B., et al. High-throughput SNP genotyping on universal bead arrays. Mutat. Res./Fundam and Mol. Mech. of Mutagenesis. 573 (1), 70-82 (2005).
- Ragoussis, J. Genotyping technologies for all. Drug Discov. Today: Technol. 3 (2), 115-122 (2006).
- Wu, C. C., Shete, S., Jo, E. J., et al. Whole-Genome Detection of Disease-Associated Deletions or Excess Homozygosity in a Case-Control Study of Rheumatoid Arthritis. Hum. Mol. Genet. , (2012).
- Green, E. K., Hamshere, M., Forty, L., et al. Replication of bipolar disorder susceptibility alleles and identification of two novel genome-wide significant associations in a new bipolar disorder case-control sample. Mol. Psychiatry. , (2012).
- Shete, S., Hosking, F. J., Robertson, L. B., et al. Genome-wide association study identifies five susceptibility loci for glioma. Nat. Genet. 41 (8), 899-904 (2009).
- Inc Illumina. . Infinium HD Ultra User Guide 11328087 RevB-1. , 15-101 (2009).
- Turner, S., Armstrong, L. o. r. e. n. L., Yuki Bradford, ., et al. Quality Control Procedures for Genome Wide Association Studies. Curr Protoc Hum Genet. , 1-19 (2011).
