Un ensayo de microplacas para evaluar los efectos químicos sobre RBL-2H3 mástil degranulación: Efectos de Triclosan y sin uso de un disolvente orgánico

Los mastocitos son altamente granular células inmunes efectoras que sirven como mediadores en el asma, las alergias, parásitos de defensa y la carcinogénesis ^13-16. Ellos residen en casi todos los tejidos vascularizados ^15, donde se almacenan de forma segura mediadores inflamatorios y alérgicos en los gránulos citoplasmáticos hasta que se activa a degranulación. La desgranulación es la exocitosis de gránulos unidos a la membrana, lo que resulta en la liberación de mediadores farmacológicamente activos, tales como histamina, triptasa, y los leucotrienos ^15. Este proceso resulta en la iniciación de las reacciones de hipersensibilidad de tipo I que son críticos en la defensa contra los parásitos de montaje, así como el inicio de las respuestas alérgicas, asmáticas, y carcinogénicos ^15.

Los mastocitos y basófilos expresan receptores varepsilon RI, los receptores de alta afinidad para la inmunoglobulina E (IgE) ^17. La exposición a un alérgeno o antígeno provoca la agregación de múltiples receptores varepsilon RI de IgE enlazados a ^17, y es este so-llamado "reticulación" de los receptores de Fc de IgE unidas a que inicie el proceso de desgranulación: una cascada de eventos de fosforilación de tirosina, la activación de la fosfolipasa C, flujo de calcio desde las reservas internas, y la afluencia de calcio en la célula ^18. Este influjo de calcio es necesario para la desgranulación, y, además, señales de fusión de gránulos con la membrana antes de causar la exocitosis de los gránulos ^15. Experimentalmente, un ionóforo de calcio se puede utilizar para transportar calcio directamente a través de la membrana de la célula ^19, que esencialmente no pasa por todos los pasos de transducción de señales antes de la etapa influjo de calcio ^20, lo que permite la identificación de un objetivo por vía de un tóxico como aguas arriba o aguas abajo de señalización de calcio ^20.

La desgranulación se puede medir con rapidez y eficacia mediante el control de la liberación de β-hexosaminidasa en sobrenadante de células, que se libera linealmente a partir de los gránulos junto con histamina ^6, pero is mucho más fácil de detectar utilizando una reacción enzima-sustrato simple y un lector de microplacas a ensayo el producto fluorescente. Esta microplaca de ensayo, como se detalla en la sección de protocolo, se basa en un método robusto desarrollado originalmente por Naal et al. ^1, que cuantifica la escisión del sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-N-acetil-β-D-glucosaminida por β- hexosaminidasa. Hemos modificado el ensayo a efectos de prueba de los fármacos y sustancias tóxicas, con triclosán resaltado aquí. Este método cuantifica con fiabilidad la desgranulación, es una alternativa económica a, por ejemplo, métodos de detección de citometría de flujo basados ​​en ^21, y tiene el potencial de que se presta muy bien a la selección de alto rendimiento de una amplia variedad de fármacos contra la alergia, así como inmunotóxicos o sustancias químicas alergénicas. Este último punto es particularmente importante a la luz de las "Pruebas de Toxicidad 2007 informe del Consejo Nacional de Investigación en el siglo ^21: una visión y una Stratgia "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), que aboga por el desarrollo de las pruebas de toxicología de alto rendimiento que utilizan cultivo de células para reducir el costoso uso de animales de laboratorio tradicionales tales como ratones. El protocolo desarrollado por la desgranulación de Naal et al. ¹ y modificado por nosotros ^2, utiliza la línea de células RBL-2H3, que es un modelo bien aceptado homóloga a mastocitos de la mucosa humanos o basófilos ^3-5. (Los métodos para el cultivo de células RBL-2H3 se detallan en Hutchinson et al. ^22). Este ensayo probablemente podría ser adaptado a cualquier tipo de célula mástil adjunto.

Triclosan (TCS) es un antimicrobiano de amplio espectro que se ha utilizado durante más de 30 años en los hospitales, productos de cuidado personal, y bienes de consumo ^23,24. El modo de acción antimicrobiana de la característica de TCS es la inhibición de la biosíntesis de ácidos grasos, probablemente mediante la inhibición de enoil-aciloproteína portadora reductasa ^25,26. Se encuentra en todo el mundo en una amplia gama de productos de consumo, tales como gel de ducha, loción para las manos, pasta de dientes, enjuague bucal, y en jabones de tocador en concentraciones de hasta el 0,3% o 10 mM ^24. El uso generalizado de TCS se ha traducido en niveles detectables en los seres humanos ^{27 a 29} y en los ríos y arroyos ^30. Un estudio realizado por Allmyr et al. ²⁷ demostró que los ECT y sus metabolitos están presentes tanto en el plasma y la leche de las madres lactantes. Es importante destacar que, TCS se absorbe fácilmente en la piel ^31-37. Queckenberg et al. Encontraron ³⁷ ~ 10% de absorción de un ~ 70 mM de TCS crema en la piel humana dentro de 12 horas, lo que resulta en una concentración significativa en la piel, donde residen las células cebadas.

TCS ha demostrado clínicamente para controlar la enfermedad alérgica en la piel humana ^7-11, pero el mecanismo por el cual TCS alivia las enfermedades alérgicas de la piel ha sido desconocido ^38. Uso de la microplaca de ensayo fluorescente detailed en este video, recientemente hemos demostrado que TCS, a concentraciones tan bajas como 2 M, amortigua significativamente la función de los mastocitos y degranulación, proporcionando una posible explicación de estos datos clínicos ^2. Además de proporcionar una explicación de estos datos clínicos, nuestros hallazgos en Palmer et al. ² sugieren que los ECT se dirige a moléculas de señalización aguas abajo de la entrada de calcio. Debido a la importancia de la señalización de calcio en muchos inmunológica y otros procesos biológicos, TCS potencialmente podría tener efectos adversos en una amplia variedad de procesos biológicos necesarios. De hecho, Udoji et al. ³⁹ demostraron que TCS suprime la actividad lítica de las células asesinas naturales humanos, otra importante función inmune innata.

Más allá de su potencial como una ayuda terapéutica en la enfermedad alérgica de la piel (o, a la inversa, como un inmunotóxico), TCS también puede ser un disruptor endocrino ^40-49. Así, un procedimiento claro sobre cómo preparar esta sustancia química en solución is de interés para los toxicólogos. Debido a TCS es una pequeña molécula hidrófoba, los vehículos orgánicos se utilizan a menudo para que sea más soluble en agua. En la mayoría de los estudios de toxicidad donde TCS ha sido probado, la preparación ha implicado la disolución en agua con la ayuda de un disolvente orgánico tal como etanol, acetona, o aceite ^2,50,51. Sin embargo, muchas veces estos disolventes son biológicamente activos a sí mismos, lo que complica la interpretación de los datos de la sustancia problema ^51. De hecho, de acuerdo con Rufli et al. ⁵² y otros ^53, se recomienda que las soluciones de prueba para los experimentos de toxicidad acuática se preparan utilizando métodos físicos sobre los métodos químicos, debido a la posibilidad de disolventes químicos para crear artefactos de toxicidad. Hemos demostrado anteriormente que los ECT disolvió en 0,24% de etanol / agua (vol / vol) y se sometió a ultrasonidos durante 30 min amortigua RBL degranulación de los mastocitos ^2. El etanol a concentraciones más altas que 0,24% se ha demostrado para amortiguar la degradación de los mastocitoscanulación ^{54,55-ejemplos} de los efectos de confusión potenciales de disolventes orgánicos en los estudios de toxicidad.

No sólo es importante tener en cuenta el efecto de los disolventes sobre el organismo o las células utilizadas para el estudio, pero también es importante para controlar el efecto de un disolvente sobre la propia sustancia de ensayo. Por ejemplo, Skaare et al. ⁵¹ encontraron que la disolución de TCS en polietileno glicol (comúnmente encontrado en los dentífricos y enjuagues bucales) debilitada efectos anti-bacterianos y anti-placa en las mujeres sanas, mientras que la disolución en aceites causó una pérdida completa de la función. Por lo tanto, la capacidad de los diferentes disolventes para modular tóxico y drogas, incluyendo TCS, efectos deben ser considerados en el diseño de ensayo. Uso de aceites o aditivos de sabor puede interferir con los efectos de TCS en diversos productos ^50,51.

En un esfuerzo por eliminar la necesidad de utilizar disolventes orgánicos, hemos mejorado sobre nuestro método para disolver TCS ² mediante la eliminación de la utilización de un sol orgánicodesahogarse. En el presente protocolo, disolvemos gránulos TCS directamente en tampón acuoso con el calor (≤ 50 ° C), a continuación, compruebe que la concentración de esta población TCS por espectrofotometría UV-Vis. Estas mejoras son posibles porque TCS es soluble en agua hasta 40 mM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) y se ha demostrado para resistir la degradación cuando se calienta a 50 ° C ( http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. También tenemos el beneficio añadido de espectrofotometría UV-Vis, como TCS también se conoce para absorber fuertemente a 280 nm ⁵⁸ con un coeficiente de extinción molar de 4200 L / mol / cm ^12.

Este protocolo proporciona una manera sencilla, pero eficaz para disolver gránulos de TCS en un tampón sin la ayuda de un disolvente orgánico, incluyendo bajo costo y verificación rápidade la concentración, y describe un potente microplaca de ensayo fluorescente para el seguimiento de los efectos químicos sobre la desgranulación de los mastocitos.