Een Microplate Assay aan chemische Effecten op RBL-2H3 mestceldegranulatie Assess: Effecten van Triclosan, zonder gebruik van een organisch oplosmiddel

Mestcellen zeer kristalsuiker immuuneffectorcellen die dienen als belangrijke bemiddelaars bij astma, allergieën, parasieten defensie en carcinogenese ^13-16. Zij verblijven in bijna elk gevasculariseerd weefsel ^15, waar ze veilig allergische en inflammatoire mediatoren slaan in cytoplasmatische korrels totdat geactiveerd om degranuleren. Degranulatie is de exocytose van membraan-gebonden korrels, waardoor de afgifte van farmacologisch werkzame mediatoren zoals histamine, tryptase en leukotriënen ^15. Dit proces resulteert in de opening van type I overgevoeligheidsreacties die kritisch montage verdediging tegen parasieten als inleiding allergische, astmatische en carcinogeen reacties ^15.

Mestcellen en basofielen expressie FcsRI receptoren, de hoge affiniteit receptoren voor immunoglobuline E (IgE) ^17. Blootstelling aan een allergeen of antigen veroorzaakt aggregatie van meerdere IgE-receptoren gebonden FcsRI ^17, en het is deze so zogenaamde "crosslinking" of IgE gebonden Fc receptoren die de degranulatie initieert: een cascade van tyrosine fosforylatie gebeurtenissen, de activering van fosfolipase C, efflux van calcium uit interne opslag en instroom van calcium in de cel ^18. Dit calcium influx is noodzakelijk voor degranulatie en voorts signalen granule fusie met het membraan voor het veroorzaken granule exocytose ^15. Experimenteel kan een calciumionofoor worden gebruikt shuttle calcium direct over het celmembraan ^19, dat in wezen alle omzeilt signaaltransductie stappen vóór de calcium influx stap ^20, voor de identificatie van een route doel door een giftige stof als stroomopwaarts of stroomafwaarts van calcium signalering ^20.

Degranulatie kan snel en effectief worden gemeten door het volgen van het vrijkomen van β-hexosaminidase in cel supernatant, die lineair vrijkomt uit de granules samen met histamine ^6, maar iis veel gemakkelijker te detecteren met behulp van een eenvoudige enzym-substraat reactie en een microplaat lezer assay het fluorescerende product. Dit microplaat test, zoals beschreven in de paragraaf protocol is gebaseerd op een robuuste methode oorspronkelijk ontwikkeld door Naal et al.. ^1, waarbij de splitsing van het fluorogene substraat 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide kwantificeert door β- hexosaminidase. We hebben de test aangepast om te testen effecten van geneesmiddelen en toxische stoffen, met triclosan gemarkeerd hier. Deze methode betrouwbaar kwantificeert degranulatie, is een goedkoop alternatief voor bijvoorbeeld flowcytometrische gebaseerde detectiemethoden ^21, en ​​heeft de potentie om zich goed lenen voor high-throughput screening van een groot aantal anti-allergische geneesmiddelen, alsmede immuno of allergene stoffen. Dit laatste punt is bijzonder belangrijk in het licht van de 2007 National Research Council rapport "Onderzoek naar de toxiciteit in de ^21e eeuw: Een visie en een Stratgie "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), die pleit voor de ontwikkeling van high-throughput toxicologische tests die celcultuur gebruiken om het kostbare gebruik van traditionele proefdieren zoals muizen te verminderen. De degranulatie protocol ontwikkeld door Naal et al.. ¹ en gewijzigd door ons ^2, maakt gebruik van de RBL-2H3 cellijn, die een goed geaccepteerd model homoloog aan menselijke mucosale mestcellen of basofielen ^3-5. (Werkwijzen voor het kweken van RBL-2H3 cellen zijn beschreven in Hutchinson et al.. ^22). Deze test kan waarschijnlijk worden aangepast aan elke aangesloten mast celtype.

Triclosan (TCS) is een breed-spectrum antimicrobiële die is gebruikt voor meer dan 30 jaar in ziekenhuizen, producten voor persoonlijke verzorging, en consumptiegoederen ^23,24. De werkingswijze van antimicrobiële eigenschap TCS is de remming van vetzuur-biosynthese, waarschijnlijk door remming enoyl-acyldragereiwit reductase ^25,26. Het is wereldwijd te vinden in een breed scala van consumentenproducten, zoals douchegel, handcrème, tandpasta, mondwater, en in de hand zepen bij concentraties tot 0,3% of 10 mM ^24. Wijdverbreide gebruik van TCS heeft geresulteerd in detecteerbare niveaus in mensen ^27-29 en in rivieren en beken ^30. Een studie uitgevoerd door Allmyr et al.. ²⁷ aangetoond dat TCS en zijn metabolieten aanwezig in zowel het plasma en melk van zogende moeders zijn. Belangrijker is TCS gemakkelijk geabsorbeerd in de huid ^31-37. Queckenberg et al.. Gevonden ³⁷ ~ 10% opname van een ~ 70 mM TCS room in menselijke huid binnen 12 uur, met een aanzienlijke concentratie in de huid, waar de mast cellen verblijven.

TCS is klinisch aangetoond dat de mens allergische huidziekte ^7-11 beheren, maar het mechanisme waardoor TCS verlicht allergische huidziekten is onbekend ³⁸ geweest. Met behulp van de fluorescerende microplate assay detailed in deze video, we onlangs aangetoond dat TCS, bij concentraties zo laag als 2 pM aanzienlijk gedempt mestcel functie en degranulatie, die een mogelijke verklaring voor deze klinische gegevens ^2. Naast het leveren van een verklaring voor deze klinische data, onze bevindingen in Palmer et al.. ² suggereren dat TCS richt signaalmoleculen stroomafwaarts van calcium influx. Vanwege het belang van calcium signaling in vele immunologische en andere biologische processen zouden TCS mogelijke nadelige effecten op een grote verscheidenheid van biologische processen noodzakelijk. In feite, Udoji et al.. ³⁹ toonde aan dat TCS onderdrukt menselijke natuurlijke killer cel lytische activiteit, een andere belangrijke aangeboren immuunsysteem.

Naast zijn potentieel als een therapeutisch hulpmiddel bij allergische huidziekte (of, omgekeerd, als immunotoxicant) kan TCS ook endocriene verstoorder is ^40-49. Zo, een duidelijke procedure over hoe dit chemisch bereiden in oplossing is van belang zijn voor toxicologen. Omdat TCS is een klein hydrofoob molecuul, zijn organische voertuigen vaak gebruikt om het meer in water oplosbaar te maken. In de meeste toxiciteit wanneer TCS is getest, is betrokken preparaat oplossing in water met behulp van een organisch oplosmiddel zoals ethanol, aceton of olie ^2,50,51. Echter, vaak tijden deze oplosmiddelen zijn biologisch actieve zelf, daardoor bemoeilijkt de interpretatie van de test chemische gegevens ^51. In feite, volgens Rufli et al.. ⁵² en ⁵³ anderen, wordt aanbevolen dat testoplossingen voor aquatische toxiciteit experimenten worden bereid met fysische werkwijzen via chemische werkwijzen vanwege de mogelijke chemische oplosmiddelen toxiciteit voorwerpen creëert. We hebben eerder aangetoond dat TCS opgelost in 0,24% ethanol / water (vol / vol) en gesoniceerd gedurende 30 min dempt RBL mestcel degranulatie ^2. Ethanol bij hogere concentraties dan 0,24% is aangetoond mast cell afbraak dempennulation ^{54,55-voorbeelden} van de potentieel verstorende effecten van organische oplosmiddelen op toxiciteit.

Niet alleen is het belangrijk om het effect van oplosmiddelen op het organisme of cellen voor onderzoek beschouwen, maar het is ook belangrijk om het effect van een oplosmiddel toezicht op de teststof zelf. Bijvoorbeeld, Skaare et al.. ⁵¹ vonden dat oplossen TCS in polyethyleenglycol (vaak gevonden in tandpasta en mondwater) verzwakt anti-bacterieel en anti-plaque effecten bij gezonde vrouwelijke vrouwen, terwijl oplossen in olie als gevolg van een volledig verlies van functie. Daarom is het vermogen van verschillende oplosmiddelen te moduleren ingedeeld en geneesmiddelen met inbegrip TCS, het effect worden overwogen in deze ontwerpen. Gebruik van oliën of smaakstoffen kunnen interfereren met de effecten van TCS in diverse producten ^50,51.

In een poging om de noodzaak om organische oplosmiddelen te elimineren, verbeterde we op onze werkwijze voor het oplossen TCS ² door het elimineren van het gebruik van een organisch solventileren. In het huidige protocol, ontbinden we TCS korrels direct in waterige buffer met warmte (≤ 50 ° C), en controleer de concentratie van deze TCS voorraad door UV-Vis spectrofotometrie. Deze verbeteringen zijn mogelijk omdat TCS is oplosbaar in water tot 40 uM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) en is aangetoond dat afbraak weerstaan ​​bij verhitting tot 50 ° C ( http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. We hebben ook het extra voordeel van UV-Vis spectrofotometrie als bedrijf ook bekend dat sterk absorbeert bij 280 nm ⁵⁸ met een molaire extinctiecoëfficiënt van 4200 L / mol / cm ^12.

Dit protocol voorziet in een eenvoudige, maar effectieve manier om TCS korrels oplossen in een buffer zonder de hulp van een organisch oplosmiddel, zoals lage kosten en snelle verificatievan de concentratie, en beschrijft een krachtige fluorescerende microplate assay voor de monitoring chemische effecten op mestceldegranulatie.