Kwantificering van de Respiratory Burst Response als een indicator van het aangeboren immuunsysteem Gezondheid in zebravis

Het immuunsysteem bestaat uit twee takken: aangeboren en adaptieve immuniteit. Aangeboren immuniteit evolutionair veel ouder dan adaptieve immuniteit. Ongewervelde dieren zijn momenteel gedacht dat alleen aangeboren immuniteit hebben, terwijl gewervelde dieren bezitten zowel het aangeboren en adaptieve takken. Terwijl adaptieve immuniteit verleent specifieke en langdurige immuniteit voor bepaalde ziekteverwekkers, aangeboren immuniteit is een onmiddellijke reactie op binnendringende bacteriën, virussen en schimmels. Een cruciaal aspect van de aangeboren immuunrespons omvat de afgifte van cytokinen en chemokinen, die resulteert in ontsteking en werving van fagocyten (bijvoorbeeld macrofagen, neutrofielen) te overspoelen en vernietigen vreemde indringers.

Succesvolle aangeboren immuunresponsen omvatten: (1) opname van binnendringende micro-organismen, (2) inductie van de geschikte signalering cascades (bv. afgifte van cytokinen en chemokinen), (3) een goede ontwikkeling / voldoende aantallen fagocyten; (4) Migratie van fagocyten aan plaatsen van infectie (5) afblazen van pathogenen, en (6) vernietiging van micro-organismen overspoeld. Een tekort aan een van deze stappen kunnen leiden tot de gastheer overweldigd door en bezwijken aan de infectie. Een robuuste aangeboren immuunrespons is van vitaal belang voor de gezondheid van organismen, omdat het de eerste lijn van verdediging tegen ziekteverwekkers in alle planten en dieren. In gewervelde dieren, het versterkt ook de adaptieve immuunrespons ^1. Daarom is het essentieel dat wij in staat om alle aspecten van de aangeboren immuunrespons evalueren om beter begrijpen en zijn functie te optimaliseren.

Veel model organismen worden gebruikt om aangeboren immuniteit bestuderen, variërend van Arabadopsis naar C. elegans Drosophila aan muizen aan gekweekte menselijke cellen. Een voordeel van het gebruik van de zebravis (Danio rerio) modelsysteem om aangeboren immuniteit bestuderen is dat de zebravis is een gewerveld dier, met zowel aangeboren en adaptieve imschap, maar de ontwikkeling van aangeboren en adaptieve immuniteit zijn tijdelijk gescheiden. Zebravis uitsluitend op aangeboren immuniteit voor bescherming tegen infectie tot adaptieve immuniteit wordt volledig functioneel, die ongeveer 4-6 weken na de bevruchting ² optreedt. Naast de gereedschappen voor genetische manipulatie, optische helderheid en snelle, externe ontwikkeling, aangeboren immuniteit als het principe wijze van verweer in de zebravis embryo's biedt een vereenvoudigd model waarin om de complexiteit van de aangeboren immuunrespons in vivo te bestuderen.

Meerdere protocollen ontwikkeld om verschillende aspecten van de aangeboren immuunrespons in zebravis embryo's te beoordelen. Microarrays en RNAseq hebben gevalideerd dat de cytokine profielen uitgelokt door de zebravis aangeboren immuunrespons zijn vergelijkbaar met die van mensen en hebben ook voorgesteld de betrokkenheid van onverwachte genen bij aangeboren immuniteit ^3,4. De transparantie van de zebravis embryo en tl, transgeneic stammen van ziekteverwekkers en zebravis mogelijk maken visualisatie van dynamische gastheer-pathogeen interacties in vivo in real time. Transgene zebravis embryo GFP onder controle van de neutrofiel-specifieke promoter myeloperoxidase ^5,6 of macrofaag-specifieke promotor MPEG1 ⁷ hebben het mogelijk te visualiseren en kwantificeren fagocyt migratie naar gebieden van gelokaliseerde infecties ⁸ alsmede fagocytose en vernietiging van zichtbaar gemaakt fluorescent gelabelde pathogenen ^8,9. Zebravis embryo's zijn ook ontvankelijk voor het genereren van hoog-assays en chemische schermen. Dienovereenkomstig, high-throughput methoden transcriptoomanalyse na infectie ¹⁰ en fagocytensysteem migratie naar sites van chemisch geïnduceerde schade ¹¹ zijn onlangs ontwikkeld.

Van de hierboven genoemde technieken, geen kwantitatieve beoordeling van de laatste fase van een ziekteverwekker vernietiging door fagocyten. Deze laatste faseomvat een respiratoire burst (productie van ROS en andere giftige stoffen), die overspoeld ziektekiemen te doden. Het enzym NADPH oxidase is een belangrijke bron van ROS in fagocyten. Montage van de subeenheden van het NADPH oxidase enzym leidt tot overdracht van elektronen aan zuurstof, superoxide anionen. Door opeenvolgende enzymatische reacties, superoxide kan vervolgens worden omgezet in waterstofperoxide en hypochloorzuur (Figuur 1A). Het is de respiratoire uitbarsting van fagocyten die ziekteverwekkers doodt en dus de kwantificering van de respiratoire uitbarsting potentieel van zebravis embryo is indicatief voor de algehele gezondheid aangeboren immuunsysteem. We hebben een fluorescentie-gebaseerde test voor de respiratory burst in groepen van afzonderlijke zebravis embryo ¹² kwantificeren. Deze test maakt gebruik van de niet-fluorescerende, gereduceerde vorm van een in de handel verkrijgbaar, celpermeable kleurstof. Deze kleurstof, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (H2DCFDA), wordt omgezet in het fluorescent verbinding 2 ', 7'-dichloorfluoresceïne (DCF), na oxidatie. De diverse ROS gegenereerd door de fagocyt respiratory burst kan oxideren H2DCFDA en het genereren van fluorescentie ^24. Het uiterlijk van fluorescentie kan worden gebruikt om te kwantificeren en vergelijken respiratory burst reactie tussen groepen zebravis. De proteïne kinase C agonist forbolmyristaatacetaat (PMA) wordt gebruikt om chemisch te induceren NADPH oxidase ROS produceren en verhogen fluorescentie metingen (Figuur 1B). Hierin geven we een gedetailleerd protocol van een aangepaste en geoptimaliseerde versie van deze zebravis embryo ademhalingsuitbarsting assay. Deze test kan worden gebruikt voor het vergelijken van de respiratory burst tussen groepen afzonderlijke zebravis embryo's in de tijd en / of in antwoord op experimentele manipulaties (bijv. morfolino-eiwit gemedieerde knockdown). Het gebruik van deze werkwijze, samen met andere zebravissen aangeboren immuniteit assays, zal een completer beeld van de complexe en kritische biedenaangeboren immuunrespons.